魚腥藍細菌PCC 7120游離DnaA的增加降低異形胞頻率

李 靜 楊毅玲 張承才

(1. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

魚腥藍細菌PCC 7120(Anabaenasp. PCC 7120)屬于念珠藻目念珠藻科念珠藻屬, 是由多個細胞組成的固氮絲狀藍細菌, 在營養充分的環境中, 魚腥藍細菌菌絲由營養細胞組成, 24h完成一次細胞增殖, 同時能夠利用環境中的化合態氮源, 如硝酸鹽和銨鹽等, 合成自身所需氨基酸從而保證存活[1,2]。當環境中化合態氮源缺乏時, 菌絲上5%—10%的營養細胞在24h內就會分化出一個具有固氮功能的異形胞, 相當于每10—20個營養細胞之間會形成一個異形胞, 用來固定空氣中的氮氣用于保障菌絲的存活[3,4]。這種半規則的排列, 形成2種類型細胞組成的絲狀體[5], 其中營養細胞能夠固定CO2進行光合作用, 異形胞可以進行固氮作用, 這2種不同類型的細胞通過相互的營養物質交換, 可以形成一個簡單多細胞的生存模式[6]。異形胞的分化是已知的最為古老的細胞分化形式之一。有文獻報道在oriC及dnaA-oriC-dnaN附近插入Ω片段會改變調控異形胞發育的關鍵基因HetN和HetR的轉錄及翻譯, 最終影響異形胞的分化[7]。oriC是DNA復制起始蛋白DnaA的結合位點。前期研究[8]表明, 在魚腥藍細菌PCC 7120中, 作為細胞周期中DNA復制起始蛋白DnaA參與細胞分化與細胞分裂的調控。DnaA起始復制是通過其結合oriC附近的DnaA box, 解鏈AT富集區開始的。OriC和DnaA box的序列相對保守, 在基因組上的位置也有一定的規律性。有些細菌的oriC或DnaA box在基因組位置分布上和DNA復制相關的dnaA基因的距離較近[9]。通過分析魚腥藍細菌PCC 7120基因組上DnaA box和dnaA基因的分布情況, 揭示了在魚腥藍細菌PCC 7120中, 染色體上的DnaA box并不是隨機分布, DnaA box和dnaA處在同一區域[10]。而且, 魚腥藍細菌的多個DnaA box也都在oriC區域上[10]。根據報道, 藍細菌oriC均與dnaN緊鄰并分布于非編碼區, 附近分布有DnaA box, 拷貝數從2個到12個不等。魚腥藍細菌oriC附近有6個成串分布的DnaA box[7,11]。C端與dnaN緊鄰, N端與dnaA基因相鄰, 魚腥藍細菌是少數幾種oriC與dnaA基因相鄰的藍細菌。

另有對魚腥藍細菌PCC 7120的研究發現,dnaA缺失突變體的細胞生長和DNA復制與野生型相比沒有明顯差別[12], 魚腥藍細菌與真核生物染色體復制類似, 均含有多個復制起點且不同步起始復制[13—15]。dnaA對于魚腥藍細菌 DNA的復制及細胞生長來說都不是必需的[12]。dnaA的缺失不影響魚腥藍細菌PCC 7120的DNA復制和細胞生長, 這說明一些非共生藍細菌譜系在多樣化進程中喪失了對DnaA的功能依賴[12]。

由上述可知, 盡管dnaA對魚腥藍細菌PCC 7120的DNA復制和細胞生長來說并不重要, 但其對異形胞分化有重要作用, 迄今為止, 其作用機理尚不明確, 本研究針對該問題, 擬以魚腥藍細菌PCC 7120為對象展開研究, 旨在進一步探究細胞周期和異形胞分化之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌DH5α、HB101(pRL623)和J53(RP4)均由本實驗室保存; 魚腥藍細菌PCC 7120由本實驗室保存; 質粒pCT、pCint2和pSfgfp-Sp均由本實驗室構建或保存; 質粒pRL271ΩoriC和pRL271ΩdnaAN均從華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室藍細菌室獲得。

1.2 實驗引物

本研究所用引物(表 1)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成, DNA序列測序由鉑尚生物技術有限公司及武漢擎科生物有限公司完成。魚腥藍細菌基因序列信息來自cyanobase (http://genome.microbedb.jp/cyanobase)。

表1 實驗中所用主要引物Tab. 1 Primers used in this study

1.3 培養基配方及培養條件

本實驗主要涉及大腸桿菌和魚腥藍細菌的培養。

大腸桿菌于LB液體培養基37℃, 180 r/min或固體(1.5%)培養基37℃下培養。LB液體培養基配方(1 L): 蛋白胨10 g, 酵母粉5 g, 氯化鈉10 g。若為固體培養基, 則在液體培養基的基礎上添加1.5%的瓊脂條或瓊脂粉; 121℃, 101.53 kPa滅菌30min[11]。大腸桿菌在培養時涉及的抗生素使用濃度為: Ampicillin(氨芐青霉素), 100 μg/mL; Kanamycin(卡那霉素), 50 μg/mL; Chloramphenicol(氯霉素), 25 μg/mL; Spectinomycin(壯觀霉素), 100 μg/mL。

魚腥藍細菌通常于硝酸鹽培養基BG11或缺氮培養基BG110中培養, BG110用于異形胞的誘導。液體培養條件為30℃, 120 r/min, 500—3000 lx連續光照培養; 固體(1.2%)培養條件為30℃, 500—3000 lx連續光照培養。BG11培養基配方(1L): NaNO31.5 g,K2HPO40.04 g, MgSO4·7H2O 0.075 g, CaCl2·2H2O 0.036 g, Citric acid 0.006 g, Ferric ammonium citrate 0.006 g, EDTANa20.001 g, Na2CO30.02 g, A5(Tracemental solution)1 mL。其中A5(Trace mental solution)配方(1L): H3BO32.86 g, MnCl2·4H2O 1.86 g,ZnSO4·7H2O 0.22 g, Na2MoO4·2H2O 0.39 g, CuSO4·5H2O 0.08 g, Co(NO3)2·6H2O 0.05 g。BG110培養基與BG11培養基配方相仿, 只是在BG110培養基中不添加NaNO3。若為固體培養基, 則需添加1.2%的瓊脂粉[11], 121℃、101.53 kPa滅菌30min。魚腥藍細菌在培養時涉及的抗生素使用濃度為: Neomycin(新霉素), 100 μg/mL; Spectinomycin(壯觀霉素),5 μg/mL; Streptomycin(鏈霉素), 2.5 μg/mL。

1.4 實驗所用主要分子生物學試劑

本研究中使用的限制性核酸內切酶及T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司, 金牌MIX高保真DNA聚合酶購自武漢擎科, Phanta高保真DNA聚合酶購自諾唯贊生物科技有限公司, 質粒抽提試劑盒、基因組抽提試劑盒、PCR產物回收及膠回收試劑盒和RNALater購自武漢川流生物科技有限公司。

1.5 PCR擴增條件及主要質粒構建

pCT-alr2009質粒用于過表達DnaA(由alr2009編碼)。使用引物P3和P4通過聚合酶鏈式反應擴增載體pCT, 反應條件為: 94℃預變性5min; 94℃變性30s, 59℃退火30s, 72℃延伸4min, 29個循環;72℃5min。使用引物P1和P2通過聚合酶鏈式反應擴增得到alr2009片段, 反應條件為: 94℃預變性5min; 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s,29個循環; 72℃5min。通過同源重組插入到上一步得到的載體, 得到質粒pCT-alr2009。該質粒負責alr2009基因的表達, CT啟動子指Theophylline riboswitch E(TP, 茶堿)和PpetE(Cu2+)組成的啟動子,petE啟動子啟動的強弱受銅離子(Cu2+)控制, Cu2+是啟動轉錄所必需的, riboswich E調控起始DnaA蛋白的翻譯, riboswich E受茶堿(Tp, Theophylline)的調控, 二者共同誘導基因的表達。本實驗所用Cu2+終濃度為0.25 μmol/L, Tp終濃度為1 mmol/L用于DnaA的過表達。

pCint2M-alr2009質粒用于構建dnaA(alr2009)缺失突變體。使用引物P5和P6通過聚合酶鏈式反應擴增Anabaena基因組DNA獲得alr2009基因上游的1255 bp片段(alr2009UP), 反應條件為: 94℃預變性5min; 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s,29個循環; 72℃5min。使用引物P7和P8通過聚合酶鏈式反應擴增Anabaena基因組DNA獲得由alr2009基因第1378位起始的1251 bp片段(alr2009 DW), 反應條件為: 94℃預變性5min; 94℃變性30s,55℃退火30s, 72℃延伸45s, 29個循環; 72℃5min。使用引物P9和P10通過聚合酶鏈式反應擴增載體pSfgfp-Sp得到Spectinomycin抗性基因片段, 反應條件為: 94℃預變性5min; 94℃變性30s, 58℃退火30s,72℃延伸1min, 29個循環; 72℃5min。將上述3個基因片段通過同源重組連接并插入到pCint2載體的PstⅠ和XhoⅠ位點之間, 得到質粒pCint2M-alr2009。該質粒中Sp-r兩邊序列與野生型基因組中dnaA(alr2009)基因上游1255 bp片段(alr2009UP)及下游由該基因1378位起始的1251 bp片段(alr2009DW)同源,因此可與野生型基因組發生同源重組, 從而將壯觀霉素基因插入到野生型基因組中, 利用Spectinomycin(壯觀霉素)和Streptomycin(鏈霉素)抗性及5%蔗糖進行篩選獲得DnaA缺失突變體。

1.6 魚腥藍細菌PCC 7120接合轉移(三親本雜交)

根據實驗需要, 分別取等體積的處于對數生長期的大腸桿菌HB101/pRL623(pRL623是指HB101自身攜帶的質粒)、接合菌J53/RP4和魚腥藍細菌PCC 7120這3個親本菌株, 6000 r/min, 離心3min收集菌體, 并用相應的無抗培養基洗滌2次。然后用0.2 mL無抗LB培養基重懸2種大腸桿菌, 用0.2 mL無抗的BG11培養基重懸魚腥藍細菌[11]; 將3個親本的菌液混合搖勻, 轉移至無菌的透明度較高的離心管中, 在光照培養箱中靜置培養4h以上; 將靜置后的菌液均勻涂布于無抗的BG11固體培養基平板表面, 然后把平板置于光照培養箱中培養[11]。

抗生素篩選: 培養18—24h后, 于固體培養基底部加入相應的合適濃度的篩選抗生素稀釋液, 之后置于光照培養箱繼續培養; 24h后, 翻轉平板, 使有培養基的皿底朝上, 繼續培養; 10—15d左右, 觀察平板, 成功轉入重組質粒的魚腥藍細菌將會長出相應的單菌落, 然后挑取單菌落并轉接到含相應抗生素的新鮮固體培養基平板或液體培養基三角瓶中進行擴大培養; 驗證: 抽提菌株的總DNA, PCR驗證菌株;驗證無誤的菌株繼續培養, 以進行下一步的實驗[11]。

蔗糖篩選: 將獲得的單菌落轉移到含對應抗生素BG11培養基上進行擴大培養(標記好克隆子編號)。再轉移至含相應抗生素2 mL液體培養基; 收集菌體于2 mL離心管中(1 mL菌液), 用超聲波處理,將菌絲打斷成＜10個細胞(顯微鏡觀察), 離心去除上清, 添加200—400 μL新鮮培養基, 再轉移到1—2個含5%蔗糖及對應的抗生素BG11平板, 進行雙交換突變體的篩選; 1—2周后分別挑取5—6個單菌落于新鮮相應抗生素的平板上進行擴大培養, 再轉移至液體培養, 同時對之進行驗證。

1.7 魚腥藍細菌異形胞的缺氮誘導

將魚腥藍細菌于BG11液體培養基中培養至對數生長期(A750=0.4—0.5), 6000 r/min離心2min收集菌體; 加入BG110液體培養基重懸菌體, 6000 r/min離心2min, 收集菌體; 重復上述步驟1次; 6000 r/min離心2min, 用移液器盡量除去上清培養基; 加入適量BG110培養基重懸菌體; 將菌體轉移至適宜大小的三角瓶中, 添加適量BG110培養基后置于光照搖床中培養; 24h以后鏡檢是否有異形胞的分化[11]。實驗過程中應做好三組平行試驗。

1.8 顯微鏡觀察

藍細菌和0.5%的Alcian blue染色混合, 放置1min左右進行阿爾新藍染色, 利用Olympus BX41顯微鏡對魚腥藍細菌細胞形態進行觀察, 主要步驟為取0.2—0.5 mL細胞培養液至離心管中, 靜置, 待其自然沉降; 吸取離心管底部3—5 μL細胞液, 滴于載玻片中央; 將蓋玻片置于載玻片上方, 輕壓, 趕出氣泡; 將制作好的切片置于顯微鏡載物臺中央; 低倍鏡尋找合適視野, 根據實驗需要轉換為相應的高倍鏡, 每轉換一次需重新對焦一次; 根據實驗需要切換視野或濾鏡通道, 觀察并記錄圖像[11]。

2 結果

2.1 dnaA缺失突變體、過表達株的構建及含DnaA box基因序列在基因組中的插入

起始蛋白DnaA在細胞周期中起復制起始作用,DnaA濃度的改變與細胞周期的變動緊密相連。為了探究DnaA濃度對魚腥藍細菌PCC 7120的細胞生長及異形胞發育的影響, 構建了dnaA基因(alr2009)缺失突變體以及DnaA過表達株。同時作為對照,通過改變DnaA box位點數量, 也可相應地改變游離DnaA的量。通過在魚腥藍細菌染色體中插入含有DnaA box的oriC片段及dnaA-oriC-dnaN片段來實現對DnaA濃度的改變。

通過三親本雜交的方式將構建好的pCT-alr2009(圖 1A)轉入野生型魚腥藍細菌PCC 7120中,獲得DnaA過表達株Oalr2009。同時也構建了pCint 2M-alr2009質粒(圖 1B), 通過三親本雜交的方式將構建好的整合型載體pCint2M-alr2009轉入野生型魚腥藍細菌PCC 7120中, 通過篩選獲得DnaA缺失突變體Malr2009。

圖1 pCT-alr2009(A)和pCint2M-alr2009(B)載體示意圖Fig. 1 The vector map of pCT-alr2009 (A) and pCint2M-alr2009(B)

利用引物1-up和1-dw及1-up和2-dw分別對抗性篩選得到的Oalr2009進行PCR驗證(圖 2A)。WT菌株作為對照無法擴增出目的片段, 過表達菌株中利用引物1-up和1-dw可擴增獲得目的片段1787 bp, 同時換用引物1-up和2-dw進行PCR擴增,也可獲得目的片段, 大小應為2117 bp。結果表明,篩選得到的3株Oalr2009菌株均為超表達菌株。

之后利用引物3-up和3-dw及4-up和4-dw分別對篩選得到的Malr2009克隆進行PCR驗證(圖 2B)。當使用3-up和3-dw引物時, WT菌株因不含Sp-r片段所以無法擴增出片段, 缺失突變菌株中由于alr2009基因片段被Sp-r片段置換, 因此PCR擴增后片段大小為1800 bp。當使用4-up和4-dw引物時(圖 2C),WT菌株因為含有alr2009基因片段, 因此PCR擴增后的片段大小為861 bp, 缺失突變菌株中由于alr2009基因片段被Sp-r片段置換, 因此PCR擴增后無產物。檢測結果顯示, 篩選得到的3個Malr2009菌株均可擴增得到預期的1800 bp的DNA片段, 而且沒有擴增出野生型DNA片段, 所以這3個菌株為完全分離的Malr2009雙交換突變菌株。

圖2 Oalr2009和Malr2009菌株的PCR驗證Fig. 2 The PCR verification of Oalr2009 and Malr2009

作為對照, 在將含有DnaA box的oriC片段或dnaA-oriC-dnaN片段插入到基因組的實驗中, 將pRL271ΩoriC和pRL271ΩdnaAN載體通過三親本雜交的方法, 轉入野生型魚腥藍細菌PCC 7120中, 利用壯觀霉素可以篩選到單菌落。將pRL271ΩoriC轉入魚腥藍細菌PCC 7120后得到的突變體MoriC,將pRL271ΩdnaAN轉入魚腥藍細菌PCC 7120后得到突變體MdnaAN, 用于后續的實驗作為對照。

2.2 MoriC、MdnaAN、Oalr2009和Malr2009株的異形胞分化

為了探究DnaA是否參與異形胞的發育調控,對野生型、MoriC、MdnaAN、Malr2009和Oalr2009共5株菌株在氮源缺乏條件時的異形胞發育進行了觀察, 并對異形胞頻率進行了統計。圖 3結果顯示,缺氮培養24h后, 野生型可形成成熟異形胞, 異形胞頻率為8.64%。MoriC和MdnaAN也可形成成熟異形胞, 每條菌絲中都可觀察到大量異形胞, 異形胞頻率分別為11.76%和11.73%, MoriC和MdnaAN的異形胞頻率明顯高于野生型(表 2)。結果表明,oriC和dnaA-oriC-dnaN數量均可影響魚腥藍細菌PCC 7120的異形胞形成模式。

同時, Malr2009和Oalr2009在缺氮培養24h后也形成成熟的異形胞(圖 3), Oalr2009菌絲中只能觀察到少量異形胞, 其異形胞頻率為6.97%, 低于野生型(表 2)。Malr2009的異形胞頻率為8.57%, 與野生型幾乎沒有差別(表 2)。綜上說明, 過表達增加DnaA蛋白會影響魚腥藍細菌PCC 7120的異形胞形成模式, 但是完全敲除dnaA基因不會影響魚腥藍細菌PCC 7120的異形胞形成模式。

圖3 五種菌株的缺氮表型觀察Fig. 3 Phenotypes of the five strains under nitrogen starvation

為了進一步確定DnaA對異形胞分化頻率的影響, 分別對野生型WT、MoriC、MdnaAN、Malr2009和Oalr2009這5株菌株的相鄰異形胞間營養細胞的數目進行統計, 以此反映異形胞在菌絲中的分化模式。圖 4顯示, 在氮源缺乏24h后, 野生型中異形胞間營養細胞數眾數為10, MoriC和MdnaAN中異形胞間營養細胞眾數為7, 明顯低于野生型, 這與MoriC和MdnaAN異形胞頻率明顯高于野生型的結果一致(表 2)。Malr2009的異形胞分化頻率與野生型相比無明顯差別, 這在異形胞間營養細胞間隔數統計中也可反映出來, Malr2009異形胞間營養細胞間隔眾數為9, 與野生型非常接近(圖 4)。在Oalr2009菌株中, 其異形胞間營養細胞間隔數眾數為12, 明顯高于野生型(圖 4), 這與Oalr2009的異形胞頻率低于野生型異形胞頻率的結果符合(表 2)。

圖4 五種菌株異形胞間營養細胞間隔數頻數的統計Fig. 4 Frequency of the number of the vegetative cells between heterocysts in the five strains

表2 缺氮24h后異形胞頻率Tab. 2 Heterocysts frequency after 24h of nitrogen starvation

2.3 菌株的生長狀況檢測

為了探究DnaA對魚腥藍細菌細胞生長的影響,在氮源充足和氮源缺乏的條件下, 對野生型WT、MoriC、MdnaAN、Malr2009和Oalr2009這5株菌株的生長狀況進行了檢測(圖 5)。圖 5A結果顯示, 在氮源充足的情況下, MoriC、MdnaAN、Malr2009和Oalr2009的細胞生長狀況均與WT相似。然而,在氮源缺乏時(圖 5B), MoriC和MdnaAN的細胞生長速度慢于野生型, 它們在第12天時,A750均不到0.6。Oalr2009的細胞生長略快于野生型, 其在第12天時A750約為1.2。Malr2009的細胞生長速率與野生型無明顯差異, 第12天時的A750均約為0.9。

圖5 五種菌株分別在供氮(A)和缺氮(B)條件下的生長狀況Fig. 5 Growth curves of the five strains under nitrogen replete(A) and nitrogen starvation (B) conditions

3 討論

細胞周期是指連續分裂細胞從一次細胞分裂結束到下一次細胞分裂結束所經歷的過程。在該過程中遺傳信息DNA精確地復制, 并分配到子代細胞中[16—18]。在大腸桿菌中, DNA復制的起始由起始蛋白DnaA對oriC的識別開始,oriC中含多個DnaA box, 可與DnaA結合, 在其他輔助因子的幫助下啟動復制[19—24]。但是本研究的結果(圖 3和表 2)表明DnaA缺失突變株Malr2009的細胞增殖率沒有改變。這個結論與文獻報道在魚腥藍細菌PCC 7120中DnaA并不是細胞增殖必需的蛋白[12]一致。DnaA對不同藍細菌的影響各有不同, 在細長聚球藻S. elongatus中, DnaA會影響復制起始, 其dnaA缺失突變體會降低DNA復制頻率, 但并不影響細胞生長, 且其在靜止期更有生存優勢[12,25]; 相反, 在系統進化樹上與葉綠體親緣關系更為接近的集胞藻Synechocystis和魚腥藍細菌Anabaena中, DNA復制不依賴于DnaA[12,26], 這2種藍細菌的dnaA缺失突變體的細胞生長和DNA復制與野生型相比均沒有明顯差別。由此可以看出, DnaA對復制過程的影響與系統進化關系可能相對應。有文獻報道魚腥藍細菌PCC 7120中細胞周期的抑制, 會抑制異形胞的發育[27]。結合實驗結果DnaA的增加會降低異形胞頻率, 我們推測在進化上DnaA的功能可能由調控細胞周期進化到調控異形胞頻率。在魚腥藍細菌PCC 7120中, 雖然DnaA在細胞周期并不是必需的,但是DnaA:oriC的平衡對異形胞的發育極其重要[7]。本研究的結果(圖 3和表 2)證明DnaA缺失并不會改變異形胞頻率, 但是過表達DnaA會降低異形胞的頻率。同時在本研究中通過增加DnaA結合位點oriC來降低細胞中游離的DnaA, 結果同樣證明了DnaA的增加會降低異形胞頻率。有研究[7]證明在MoriC和MdnaAN突變中異形胞發育的正調控因子hetR增加導致了異形胞頻率增加。因此我們推測通過過表達DnaA減少可用的oriC從而降低異形胞發育的正調控因子hetR, 最終導致在DnaA過表達的突變株Oalr2009異形胞頻率降低。

綜上, 本研究以DNA復制中的關鍵蛋白DnaA為切入點, 探究了魚腥藍細菌PCC 7120 DnaA與異形胞分化之間的關系, 研究表明, DnaA并不是魚腥藍細菌PCC 7120細胞生長過程所必需的, 完全敲除dnaA基因對細胞生長無影響, 但在缺氮條件下, 增加游離DnaA的數量會降低異形胞的分化頻率。此研究進一步細化并完善了異形胞分化的分子機制,為DnaA和異形胞分化過程相互關系的研究提供了一定的理論基礎, 為藍細菌的系統進化提供了更多的信息。