基于氧化應激探討毓麟珠調控TSC/Akt通路改善免疫性POI小鼠卵巢功能的機制研究

魏茂林 楊珍 董曉英 馮遜遜

早發性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)是一種嚴重的內分泌和生殖系統功能紊亂疾病，是介于卵巢儲備功能下降和卵巢早衰之間的一種卵巢低反應狀態，主要表現為卵巢內卵泡池減少和卵泡功能障礙[1]。POI的發病率逐年升高，嚴重影響了女性的生殖健康。

研究表明，POI的發生與卵巢微環境密切相關[2]。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)蛋白可以抑制卵巢氧化應激的發生，改善卵巢微環境，對卵泡發育有一定的積極作用[3]。Akt通過多種機制被激活，活化磷酸化Akt通過抑制結節性硬化癥(tuberous sclerosis complex，TSC)復合物TSC1和TSC2，直接或者間接地激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammlian target of rapamycin,mTOR)通路[4]。前期研究表明，毓麟珠可以通過激活mTOR信號通路，調整通路中S6K和4E-BPl等相關蛋白的表達，對免疫性POI模型小鼠卵泡發育有積極影響[5]。在此基礎上，本研究觀察中藥毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織氧化應激狀態、卵巢組織病理形態以及TSC1、TSC2、Akt和mTOR下游相關蛋白等表達的影響，探討其治療免疫性POI的機制機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選定84只6～8周齡動情周期正常的SPF級BALB/c雌性小鼠，體質量18～22 g。該批動物由北京維通利華公司提供，批號為SCXK(京)2012-0001。實驗經北京中醫藥大學動物實驗倫理委員會審批，批號：AEEI-2015-028。

1.2 實驗藥物

1.2.1 造模試劑 用高精度電子秤稱取6 mg ZP3透明帶多肽粉末[根據小鼠透明帶3(ZP3)330-342個氨基酸序列(NAAAAQFQIHGPR)合成，加入6 mL蒸餾水，溶解混勻，制成透明帶多肽溶液]，其中一半與等量的弗氏完全佐劑混勻作為免疫制劑，另一半與等量的弗氏不完全佐劑混勻作為免疫增強劑。透明帶多肽粉末購自杭州中肽生化有限公司(批號：CR-10-0068Z)，弗氏完全佐劑(批號：F5881)、弗氏不完全佐劑(批號：F5506)購自美國Sigma公司。

1.2.2 中藥 毓麟珠藥物組成：當歸、熟地黃、菟絲子各12 g，人參、麩炒白術、茯苓、白芍、杜仲、鹿角霜、川椒各6 g，川芎、炙甘草各3 g。中藥飲片均由北京同仁堂有限公司提供。劑型為水煎劑，小鼠給藥劑量根據“人與動物體表面積比例”配置高、中、低劑量藥液[6]，分別為每mL含生藥量0.234 g、0.468 g、0.936 g。藥物煎出后，4℃保存。

1.2.3 陽性對照藥 戊酸雌二醇片(德國拜耳公司，批號：219A2)。小鼠給藥劑量參照“人與動物體表面積比例”[6]使用去離子水配置藥液，給藥量為9 mg/mL。

1.2.4 主要試劑 蘇木素染液(北京中科萬邦生物科技有限公司，批號：517-28-2)；伊紅染液(北京中科萬邦生物科技有限公司，批號：17372-87-1)；二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司，批號：1330-20-7)；EDTA抗原修復液(北京中科萬邦生物科技有限公司)；牛血清白蛋白V(Solarbio，批號：A8020)；DAB顯色劑(北京中科萬邦生物科技有限公司)；羊抗兔IgG(H+L)，HRP(Jackson，批號：111-035-003)；羊抗鼠IgG(H+L)，HRP(Jackson，批號：115-035-003)；BCA蛋白定量試劑盒(Cwbiotech，批號：02912E)；反轉錄試劑盒(TaKaRa，批號：RR036A)；熒光定量PCR試劑(Roche，批號：04887352001)。

1.3 造模、給藥及取材

1.3.1 動物造模 通過陰道涂片挑選出動情周期正常的雌性小鼠84只，隨機選擇其中14只作為空白組，其余70只用于建立POI模型。造模小鼠于腹部皮下多點注射ZP3多肽免疫制劑(0.15 mL)，兩周后皮下多點注射ZP3多肽免疫增強劑(0.15 mL)[7]；空白組小鼠于相同時間點皮下注射等量生理鹽水。

1.3.2 分組給藥 造模結束后，通過陰道涂片觀察，動情周期紊亂則造模成功。將造模成功的70只小鼠隨機分為模型組，陽性藥組，毓麟珠高、中、低劑量組，每組14只。除空白組和模型組給予生理鹽水灌胃外，其余各組給予相應藥物灌胃。每只小鼠灌胃0.5 mL，每周給藥6天，每天1次，連續給藥6周。

1.3.3 取材 干預結束后第二天進行標本取材。心臟穿刺取血；取兩側卵巢以及子宮并稱重，其中一側卵巢放入液氮中，-80℃保存；另一側放入4%多聚甲醛中固定，待用。

1.4 檢測指標

1.4.1 小鼠卵巢組織形態 取出在多聚甲醛中固定的小鼠卵巢，進行脫水、透明處理、浸蠟包埋、切片、蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、封片，顯微鏡下觀察。

1.4.2 小鼠卵巢組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的測定 每組隨機挑選出6個在-80℃冰箱中保存的小鼠卵巢組織，梯度復溫切碎，加入蛋白裂解液后研磨，13 000 r/分鐘，4℃，離心20分鐘后取上清，蛋白質定量法測定總蛋白濃度，在酶標儀測定吸光度值，繪制出標準曲線，根據描述的蛋白濃度和標準曲線計算各指標的值。

1.4.3 小鼠卵巢組織中TSC1、TSC2、Akt蛋白表達 以免疫組化法檢測。每組隨機取出6個固定在多聚甲醛中的卵巢，用不同濃度的酒精梯度脫水，EDTA修復液修復，3%雙氧水以及牛血清白蛋白常溫孵育，一抗二抗處理后，加入顯色劑顯色，復染，梯度酒精脫水，透明處理，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.4 小鼠卵巢組織中RheB、P-4E-BP1、P-sbk1相關蛋白表達 以蛋白免疫印記法檢測。每組隨機取出6個保存在-80℃的卵巢，梯度復溫切碎，加入裂解液，勻漿取上清，利用蛋白質定量法測定蛋白濃度，根據蛋白分子量制膠，加入樣品以及Marker，進行電泳。依次轉膜、封閉，加入一抗、二抗孵育、洗膜，加入發光液、曝光、顯影、定影，最后觀察條帶狀況。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 毓麟珠對免疫性POI小鼠陰道分泌物的影響

空白組小鼠陰道涂片顯示每隔4～5天小鼠會出現明顯的動情周期，動情期間陰道涂片所見以不規則、無細胞核呈落葉狀細胞為主，為典型的無核角化上皮細胞。模型組小鼠陰道涂片顯示小鼠動情周期紊亂，表現為以有核的白細胞、嗜酸粒細胞為主。各給藥組小鼠在給藥過程中動情周期逐漸恢復，漸至穩定。

2.2 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢及子宮質量的影響

與空白組相比，造模成功后模型組小鼠卵巢以及子宮質量均明顯降低(P<0.05)。給藥6周后，雌激素組、毓麟珠各劑量組小鼠卵巢及子宮質量均增加，其中毓麟珠高劑量組增加最明顯(P<0.01)，毓麟珠中劑量組及雌激素組次之(P<0.05)，毓麟珠低劑量組僅有上升趨勢，差異具有統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組免疫性POI小鼠卵巢及子宮質量比較

2.3 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織形態的影響

HE染色結果顯示：與空白組比較，模型組小鼠卵泡數量明顯減少，卵母細胞部分透明帶縮小，顆粒細胞排列紊亂，卵母細胞形態不規整或者縮小。與模型組比較，各給藥組小鼠卵泡數量增加，卵細胞形態更加規整，顆粒細胞排列整齊，其中毓麟珠高劑量組改善最明顯。見圖1。

2.4 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織ROS、GSH-Px、SOD、MDA表達水平的影響

造模成功后，模型組氧化因子ROS、MDA明顯升高，抗氧化因子GSH-Px、SOD明顯降低(P<0.05)；給藥6周后，雌激素組、毓麟珠各劑量組氧化因子ROS、MDA明顯升高，抗氧化因子GSH-Px、SOD明顯降低，其中雌激素組效果最為明顯(P<0.01)，毓麟珠高、中、低劑量組效果稍次，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組免疫性POI小鼠卵巢組織中ROS、MDA、GSH-Px、SOD表達水平比較

2.5 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織Akt蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，Akt蛋白主要分布在卵母細胞的顆粒細胞中。造模后，模型組陽性顆粒明顯較少，著色淺，表達不明顯；各給藥組陽性顆粒表達明顯較多，著色深，表達明顯；在毓麟珠高、中、低劑量組中陽性顆粒的表達具有明顯的劑量依賴性。見圖2。

注：A 空白組；B 模型組；C 雌激素組；D 毓麟珠高劑量組；E 毓麟珠中劑量組；F 毓麟珠低劑量組。箭頭處為卵泡。

注：A 空白組；B 模型組；C 雌激素組；D 毓麟珠高劑量組；E 毓麟珠中劑量組；F 毓麟珠低劑量組。

2.6 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織TSC1、TSC2蛋白表達的影響

TSC1、TSC2蛋白主要分布在卵母細胞的顆粒細胞中。造模后，模型組陽性顆粒明顯較多，著色深，表達明顯；各給藥組陽性顆粒表達明顯較多，著色深，表達明顯。在毓麟珠高、中、低劑量組中，陽性顆粒的表達與劑量呈負相關。見圖3、圖4。

2.7 毓麟珠對免疫性POI小鼠卵巢組織RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達的影響

造模后，模型組RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)；給藥后，各給藥組RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達均明顯升高，改善較明顯的是P-4E-BP1蛋白(P<0.01)，而RheB、P-s6k1僅有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；其中毓麟珠高劑量組對RheB、P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達改善最明顯。見表3，圖5。

表3 各組免疫性POI小鼠卵巢組織RheB、P-sbk1、P-4E-BP1蛋白表達水平比較

3 討論

研究表明，POI的發生與氧化應激密切相關。體內氧化與抗氧化狀態失衡，卵巢內部微環境改變，氧化應激增加[8]。而過多的氧自由基(H2O2)可以誘導PI3K表達的下降[9-10]，PI3K通過磷酸化激活絲氨酸—蘇氨酸激酶Akt[11]，Akt通過磷酸化TSC2來抑制TSC2的活性。TSC復合物(TSC1/2)是一種抑癌基因，由三個核心亞基(TSC1、TSC2和TBC1D7)組成，是Rheb的主要上游調節因子，其中TSC2可以促進Rheb的泛素化，將Rheb從活躍形式轉化為不活躍的形式，進而抑制mTORC1的活性[12]。P-s6k1、P-4E-BP1處于mTOR的下游，受其調控，在調節卵母細胞的mRNA轉錄及翻譯方面起著重要作用[5]。

注：A 空白組；B 模型組；C 雌激素組；D 毓麟珠高劑量組；E 毓麟珠中劑量組；F 毓麟珠低劑量組。

注：A 空白組；B 模型組；C 雌激素組；D 毓麟珠高劑量組；E 毓麟珠中劑量組；F 毓麟珠低劑量組。

注：1 空白組；2 模型組；3 雌激素組；4 毓麟珠高劑量組；5 毓麟珠中劑量組；6 毓麟珠低劑量組。

毓麟珠出自《景岳全書·婦人規》，由八珍湯加菟絲子、杜仲、鹿角霜、川椒化裁而來。該方主治脾腎陽虛導致的不孕，方中四君子湯健脾益氣，使氣血化生有源；四物湯活血為主，養血為輔，使全方補而不滯；菟絲子、鹿角霜、杜仲、花椒溫肝腎，填精血，調沖任，補命門。全方溫補先天腎氣以生精，培補后天脾胃以補血，佐以活血調經補沖任，既注意腎中陰陽的平衡，又注意用藥的動靜結合，使精氣充盛，沖任通暢，進而恢復生育功能。臨床研究表明，毓麟珠加減能很好地改善脾腎陽虛型卵巢早衰患者的中醫癥狀，并且降低血清促卵泡生成素、促黃體生成素的水平，并升高雌激素的水平[13]。有動物實驗表明毓麟珠能促進小鼠卵細胞成熟，改善卵細胞質量[14]。進一步研究表明毓麟珠可以通過改善卵母細胞線粒體功能，進而改善卵母細胞質量與卵巢功能[15]。

本研究發現造模后小鼠動情周期紊亂，同時卵巢、子宮質量下降，卵泡數量減少，表現出模型的陽性改變，影響到了小鼠的生殖功能。模型組小鼠卵巢組織ROS、MDA水平相較于空白組明顯升高，GSH-Px、SOD水平相較于空白組降低，說明小鼠卵巢處于氧化應激狀態；在給予中藥毓麟珠6周之后，模型組小鼠ROS、MDA水平降低，GSH-Px、SOD水平升高，說明毓麟珠可以降低小鼠體內活性氧分子水平，同時提升相關抗氧化酶活性，抑制氧化應激狀態。相關實驗研究表明毓麟珠中的多味中藥如熟地、當歸、川芎等均能提高體內過氧化物歧化酶活性，清除體內自由基[16]，毓麟珠的抗氧化活性可能與此相關。PI3K/Akt信號通路是卵母細胞內與氧化應激以及卵泡發育密切相關的信號通路[17]，其影響卵泡發育的原因可能與TSC1/2的磷酸化密切相關。給予藥物治療后，Akt蛋白表達明顯升高，抑制氧化應激的發生，Akt表達的升高會促進TSC2與TSC1分離，結節性硬化癥復合物(TSC1/2)是抑制mTORC1的主要物質，兩者解離則解除對mTORC1的抑制，激活mTORC1[18]，從而使得mTOR信號通路活化。mTOR信號通路下游的P-s6k1、P-4E-BP1蛋白表達升高，進而激活細胞內轉錄和翻譯過程，促進細胞生長發育[19]。本研究結果進一步分析了Akt/TSC信號通路抑制氧化應激改善卵母細胞質量可能與其直接或者間接激活了mTOR信號通路密切相關。

綜上所述，毓麟珠通過調控TSC/Akt信號通路抑制氧化應激的發生，可能是減少卵母細胞以及卵泡損傷，改善卵巢微環境的重要機制。接下來的研究將進一步探究毓麟珠治療POI的靶標，并探究毓麟珠在治療POI過程中發揮主要作用的有效成份，為臨床中更加精確、有效治療POI提供依據。