恒定的自然殺傷T淋巴細胞在肝臟抗腫瘤免疫中的作用與機制

胡想金，高 耀，閭 軍

首都醫科大學附屬北京佑安醫院 肝病與腫瘤生物治療科，北京 100069

恒定的自然殺傷T細胞(invariant natural killer T cell，iNKT 細胞)屬于先天性T淋巴細胞亞群，表達自然殺傷細胞(NK細胞)相關受體的同時也表達T淋巴細胞受體(T cell receptor，TCR)，是固有免疫系統重要組成部分。活化的iNKT細胞通過釋放細胞因子及細胞間信號傳遞等方式調節微環境中適應性免疫細胞活性。iNKT細胞具有組織特異性，主要分布于機體胸腺、肝臟中，目前關于iNKT細胞的組織特異性機制尚未完全明確，但是目前越來越多證據指出iNKT細胞對肝臟免疫系統具有重要的調控作用，與肝臟疾病發生發展關系十分密切，本文就iNKT細胞的生物學特性及其在調節肝臟免疫反應中的重要作用，尤其就iNKT細胞在肝細胞癌(HCC)中的作用和機制做出綜述。

1 iNKT細胞生物學特性

自然殺傷T淋巴細胞(natural killer T cell，NKT 細胞)是天然的T淋巴細胞亞群，表達NK細胞表面標志物的同時也表達TCR，根據TCR特異性主要分為2個亞群：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ 型NKT細胞表達的TCR由恒定的TCRα鏈(小鼠Vα14-Jα18，人Vα24-Jα18)分別與相應的半恒定TCRβ鏈匹配(小鼠為Vβ8.2、Vβ7或Vβ2，人類為 Vβ11)組成[1]，因此Ⅰ型NKT細胞又被命名為invariant NKT(iNKT)細胞。iNKT細胞可以特異性識別由抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell，APC)表面CD1d結合的α-半乳糖神經酰胺(α-GalCer)[2]，正因如此，人們通過利用α-GalCer對iNKT細胞在體外進行大量擴增，因而目前對iNKT細胞的研究及了解較多。而Ⅱ型NKT細胞由于TCR表達多樣性和缺乏特異性，其主要被硫脂類抗原激活，并不受α-GalCer影響，是抑制抗腫瘤免疫的調節細胞，目前研究較少。本文主要對Ⅰ型NKT細胞，即iNKT細胞進行討論分析。

iNKT細胞雖然是T淋巴細胞的亞群，但較傳統T淋巴細胞仍有諸多不同之處。首先，iNKT細胞對經典的主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ、Ⅱ類分子遞呈的抗原無反應，其主要識別并結合由 CD1d分子(一種非多態性MHC Ⅰ類抗原遞呈分子)所遞呈的脂質抗原α-GalCer[2]，這使得iNKT細胞在進化過程中具有高度保守的特異性[3]。其次，iNKT細胞活化機制多樣，除了受α-GalCer活化外，iNKT細胞組成性表達IL-12R和IL-18R，可被微環境中IL-12和IL-18激活，此外通過Toll樣受體信號刺激APC途徑也可介導iNKT細胞活化[4]。第三，iNKT細胞具有強大的免疫調節功能，活化后的iNKT細胞能迅速分泌大量的細胞因子，如IFNγ、TNFα等，促使APC的活化，特別是誘導樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的成熟，DC通過上調共刺激因子(CD40、CD80、CD86)表達，并通過分泌IL-12和IL-18分別與iNKT細胞表面的CD40L、IL-12R和IL-18R結合進一步促使iNKT細胞活化[5]。更重要的是，iNKT細胞自身分泌的IFNγ及DC來源的IL-12、IFNγ可誘導T淋巴細胞及NK細胞活化，因此iNKT細胞被喻為連接先天性和適應性免疫反應的橋梁[6]。最后，iNKT細胞自身還可以通過CD1d、穿孔素、顆粒酶及Fas/FasL等途徑直接殺傷靶細胞[7]，從而影響疾病的發生發展。

更為特殊的是，iNKT細胞是組織歸巢和組織常駐細胞，根據特定表面標志物和特定轉錄因子可以劃分出不同功能的iNKT細胞亞群，如NKT1(分泌IFNγ為主)、NKT2(分泌IL-4為主)、NKT17(分泌IL-17為主)及NKT10(分泌IL-10為主)等亞群[8]，這些亞群在胸腺分化發育早期即出現，從胸腺出來以后以組織特異性方式歸巢在外周器官，在肝臟中最為豐富，其次是胸腺、肺、脾[9]，這主要是由于iNKT細胞的組織歸巢和組織定居特性所決定的。這些iNKT細胞亞群能夠分泌不同的細胞因子，調節不同組織定位的免疫反應。且不同組織定位的iNKT細胞亞群表達的趨化因子受體也有所差異[10-12]，例如，肝內的iNKT細胞表達高水平的CXCR3、CCR5及CCR2，其中CCR2及CCR5是炎癥相關趨化因子受體，為iNKT細胞向肝內遷移及iNKT細胞調節肝內免疫反應提供了重要作用[13]，進一步提示了iNKT細胞亞群可能以不同組織為靶點，發揮不同的免疫功能。這種組織特異分布方式也反映出iNKT細胞在肝臟生理及病理狀態下的免疫微環境中扮演著重要的角色，包括維持免疫耐受、微生物感染、自身免疫性疾病和癌癥等[14]。

2 iNKT細胞在肝臟免疫中的作用

肝臟是一個獨特的免疫器官，含有豐富的免疫細胞，包括Kupffer細胞(KC)、DC、NK細胞和T淋巴細胞等，其中T淋巴細胞及NK細胞約占肝內淋巴細胞的90%[15]。正常情況下，iNKT細胞在肝竇內巡邏，在那里含有豐富的肝竇內皮細胞及KC，狹小的肝竇不僅減緩了血液流動，肝竇內皮的單層窗孔結構進一步促進了iNKT細胞及KC捕捉病原體和循環腫瘤細胞的能力[16]。值得注意的是，肝竇內皮細胞、KC等肝內APC表達高水平的CXCL16，吸引更多的CXCR6+iNKT向肝內募集，CXCR6/CXCL16的相互作用也是肝內iNKT細胞排斥異物分子的基礎，CXCR6的缺失會減弱iNKT細胞對肝臟的保護作用[17-18]。此外，如上所述，肝內iNKT細胞表達豐富的CCR2、CCR5、CXCR3等趨化因子受體，會吸引中性粒細胞、單核細胞及髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)向肝內募集，引起肝內炎性免疫反應[19]，增加組織損傷風險。正常的肝臟如何能在肝臟不斷識別病原體外，還能保持肝內免疫系統平衡，這與免疫耐受形成有關，將在后文進行探討。

肝臟是雙血管供血系統，接受營養豐富的門靜脈(75%)和富氧的肝動脈(25%)的雙重血液供應。門靜脈結構的存在使得肝臟除接觸外周血液中病原體外，還可以通過門靜脈吸收來自腸道的病原體[20]。肝臟在長期面對大量外來抗原的負荷下，為防止于外來抗原導致的自身肝損傷，iNKT細胞通過下調TCR或者上調程序性死亡-1(programmed cell death-1，PD-1)受體的表達、促進其胞內信號分子泛素化、分泌抑制性細胞因子IL-10及TGFβ等途徑抑制機體免疫反應[21-22]，使正常的肝臟呈現免疫耐受狀態，從而維持正常肝內免疫平衡，以保證肝臟在不斷的細胞因子刺激下免受損傷。此外，研究[23]表明，CXCR6/CXCL16的相互作用不僅是肝臟免疫識別反應的重要基礎，也是iNKT細胞介導的維持免疫耐受，減少組織損傷的前提。由此可見肝臟的解剖及功能結構、iNKT細胞在微環境中與其他細胞復雜的相互作用共同創造了肝內特殊微環境，這種微環境決定了健康肝臟和炎癥之間的平衡。現已有研究[24]表明，肝內免疫失調是肝臟疾病發生的標志，免疫細胞的數量、分化及功能狀態均與肝臟疾病的發生發展有關，而iNKT細胞可以通過多種途徑維持肝內免疫穩態，由此推斷iNKT細胞的變化與肝內疾病的發生、發展息息相關。例如，Kaneko等[25]證實iNKT細胞可以上調細胞表面FasL的表達，促進穿孔素、顆粒酶及TNFα釋放并誘導肝細胞死亡，加重自身免疫肝炎的肝組織損傷，而Vα14NKT表達缺陷可以減輕對肝臟的損傷；由于飲酒過度激活iNKT細胞，導致細胞因子大量釋放及炎性細胞的聚集，加劇了肝組織損傷及肝細胞死亡[26]，促進了酒精性肝病的進展，而iNKT缺陷小鼠的肝組織損傷程度明顯減緩[27]。盡管iNKT細胞活化在某些程度上可以加重肝組織損傷，但更多的研究證實iNKT細胞還具有抗炎和保護肝臟的作用，例如在HBV/HCV感染的肝炎過程中，活化的iNKT細胞通過分泌IFNγ，抑制HBV/HCV在肝細胞內的復制，發揮抗病毒作用[28-29]；此外，HCC是肝臟各類疾病進展的最終結局，研究表明iNKT細胞的數量與功能障礙與HCC的發生、發展有關，Zahran等[30]通過流式細胞術證明HCC患者中外周血iNKT細胞表達頻率較正常人群明顯降低，且肝癌組織iNKT細胞數量及分泌IFNγ的功能顯著低于癌旁組織[31]，Xiao等[32]證實肝腫瘤的iNKT細胞和IFNγ表達是HCC復發的獨立預測因子，iNKT細胞減少會顯著增加腫瘤轉移風險，而iNKT細胞的增加則會減弱這種轉移概率[18,30]，提示iNKT細胞在抗HCC中發揮著重要的免疫調節作用。

3 iNKT細胞在HCC中抗腫瘤的作用機制

HCC通常繼發于病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝等炎癥性肝病，是危害人類健康最嚴重的癌癥之一。由于HCC惡性程度高并且發現時多數已為晚期，手術(切除、消融)及靶向藥物等治療很難阻止疾病進展，目前已有研究支持活化的iNKT細胞對腫瘤微環境的多種免疫細胞具有重要的調控作用，且這種復雜作用的結局將導致對HCC細胞的殺傷作用。最初，Miyagi等[33]發現在HCC小鼠體內通過α-GalCer直接誘導iNKT細胞活化，可以增加NK細胞對肝內腫瘤的殺傷作用。但后來人們發現，腫瘤患者的iNKT細胞對α-Galcer的反應比正常人群低，體內直接誘導iNKT增殖并活化存在一定缺陷[34]。于是Margalit等[35]通過在體外擴增iNKT細胞并回輸給肝細胞癌小鼠，觀察到血清IFNγ、IL-12及IL-4顯著升高，外周血CD8+T淋巴細胞表達升高，腫瘤生長受到抑制。研究學者[36]也在其他腫瘤中證實了iNKT細胞可以通過逆轉免疫抑制性的微環境中NK細胞及CD8+T淋巴細胞活性，間接殺傷MHC陰性或者陽性的腫瘤細胞，大大增加了體內的抗腫瘤活性。

研究[37]表明，HCC患者抗腫瘤免疫反應低下除了因為NK、CD8+T淋巴細胞衰竭外，往往還伴隨著免疫抑制性細胞，如MDSC及腫瘤相關巨噬細胞的富集和抑制性免疫檢查點，如PD-1及其配體PD-L1等上調抑制了機體抗腫瘤免疫反應。iNKT細胞除了逆轉NK及CD8+T淋巴細胞活性外，還可以在免疫抑制性的腫瘤微環境中拯救MDSC對T淋巴細胞的抑制程度[38]，促使MDSC表型發生改變(CD11b表達下降，CD86表達升高)，減弱MDSC的抑制作用，并且可能增加抗原遞呈細胞的作用達到抗腫瘤效果[39]。此外，Hix等[40]在動物實驗中證明Vα14 NKT 細胞還可以通過CD1d依賴方式識別并殺傷腫瘤相關巨噬細胞，從多方面抑制腫瘤生長，發揮抗腫瘤作用。

目前，隨著抗PD-1單克隆抗體廣泛用于原發性肝癌臨床治療，大部分患者漸漸出現耐藥，Bae等[41]發現iNKT細胞的活化能夠在抗PD-1耐藥模型中顯著抑制腫瘤生長，逆轉免疫抑制抗腫瘤藥物位點耐藥，為耐藥患者的治療帶來了希望。這也為iNKT細胞聯合抗PD-1藥物治療HCC提供了可能。此外，嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)的發展進一步擴展了iNKT細胞在腫瘤領域的應用，因為研究表明具有共刺激結構域的CAR能促進iNKT細胞分泌Th1型細胞因子，并且增加其發揮抗腫瘤能力的持久性[42]。CAR-iNKT細胞治療可以彌補CAR-T在治療HCC中的不足[43]：(1)滲透性弱，不能有效地歸巢肝臟；(2)受到MDSC及PD-1表達等塑造的免疫抑制微環境影響不能有效發揮作用；(3)未利用NK細胞的殺傷活性，“一拳難敵四手”。基于iNKT細胞的免疫治療恰好可以改善這種問題，能從恢復NK細胞、T淋巴細胞活性及干擾免疫抑制性細胞雙方面糾正HCC固有的免疫功能低下，恢復機體細胞毒性細胞功能。雖然在HCC研究方面，相關文獻報道仍較少，但總之，iNKT細胞可以從多方面改善HCC微環境的免疫抑制狀態，從而增加機體抗腫瘤活性。

4 結語

綜上所述，iNKT細胞具有強大的免疫調節特性，是肝臟免疫系統的參與者與守護者，不僅對調節正常肝臟的免疫反應具有重要意義，也在各類肝臟疾病中發揮重要的調控作用，尤其能夠在肝臟抗腫瘤免疫中逆轉CD8+T淋巴細胞、NK細胞衰竭，并且對腫瘤微環境中的免疫抑制性細胞具有負性調節作用，這為HCC的治療提供了新方向。然而關于iNKT細胞的研究大多數均來自動物模型實驗，尚需更多的臨床研究。且該免疫療法采用自體回輸，其治療效果取決于多重因素，包括iNKT細胞亞群功能，體外擴增數量，注射劑量、頻率及個體中腫瘤微環境差異等，因此在研究中需要考慮到以下幾點：(1)人類中的iNKT細胞表型多變，功能也很豐富，如何使其在發揮抗腫瘤過程中加強分泌Th1型細胞因子，或者找出其中一個具有更長發揮時效的iNKT細胞亞群以達到更好的治療效果；(2)iNKT細胞的組織特異性分布原因尚且不清楚，是否可以從了解組織分布特異性機制方面去找出一種利于iNKT細胞向肝臟遷移的基因，利用攜帶這種基因的iNKT細胞實現精準靶向治療使其更具療效：(3)雖然有證據表明iNKT細胞可以自然遷移到肝臟中，但尚無有力證據表明iNKT細胞可以遷移到肝臟腫瘤細胞表面，是否可以通過制備靶向腫瘤抗原的iNKT細胞精準實現抗腫瘤免疫。這些均需要在研究中進行不斷探索，相信通過不斷優化iNKT細胞回輸的條件，該免疫治療是實現成功的抗HCC免疫最具前景的治療方式。

作者貢獻聲明：胡想金負責文章寫作思路并撰寫論文;高耀負責修改論文; 閭軍負責指導并最后定稿。