不同亞型Numb蛋白對肝纖維化相關信號通路的影響

許燕楠，劉 平，慕永平

上海中醫藥大學附屬曙光醫院 肝病二科，上海中醫藥大學 肝病研究所，上海 201203

肝纖維化的發生是一個十分復雜的病理過程，從組織病理學角度來說，肝纖維化是慢性肝損傷條件下的創傷愈合反應，由于瘢痕組織形成改變了正常的肝臟結構和血液供應，導致肝功能障礙[1]。從細胞角度來說，慢性肝損傷導致肝實質細胞的死亡(壞死、凋亡)、Kupffer細胞活化等導致肝星狀細胞(HSC)活化，并向肌成纖維細胞分化，導致組織中實質細胞被纖維細胞替代[2]。從分子角度來說，肝纖維化形成過程中涉及多種細胞因子，包括促炎因子、促纖維化因子等以及細胞內信號通路的改變。基因層面包括組蛋白乙酰化修飾，DNA甲基化在內的表觀遺傳也與肝纖維化密切相關[3]。目前，從分子水平探索肝纖維化的發病機制，并基此開展靶向藥物的研發顯得越發重要。Numb是一個進化保守的基因，具有控制細胞不對稱分裂和細胞命運選擇、胞吞作用、細胞黏附、細胞遷移、特定底物泛素化及多種信號通路等復雜的功能[4-5]。盡管哺乳動物中Numb基因的表達模式強烈提示其在神經系統的發育中發揮關鍵作用，但該基因也在大多數成體和胚胎組織中表達，表明其作用并不局限于神經發育[4]，目前研究較多的是其在腫瘤領域的治療機制。也有研究[6]發現Numb在纖維化發生中也發揮重要作用，比如在腎纖維化中，Numb失去其特有的膜定位無法抑制Notch信號通路，導致腎小管細胞的死亡，加重纖維化進程。但尚不明確，Numb基因經選擇性剪切后翻譯的Numb蛋白不同亞型在纖維化疾病中扮演怎樣的角色。本文綜述了Numb蛋白各亞型的功能特點以及其在肝纖維化中的潛在應用前景。

1 Numb及其不同亞型的產生

Numb最早在果蠅感覺器官前體細胞中被發現[7]，其具有不對稱分布和調控不對稱分裂的特性，從而決定子代細胞命運，是重要的細胞命運決定因子。哺乳動物中的Numb表現出更為復雜的功能模式，主要與其在脊索動物譜系的共同祖先中獲得外顯子3(Exon3)有關，Exon3編碼位于Numb蛋白N端的11個氨基酸，從而產生2個不同的結構域：含有Exon3或不含Exon3的磷酸酪氨酸(phosphotyrosine binding，PTB)結構域，自Exon3出現以來，人們逐漸發現Numb蛋白的PTB結構域具有結合多種蛋白質的功能，也參與部分細胞膜定位與調控胞吞和信號通路的作用[8]。另一個重要的功能域是富含脯氨酸區域(proline rich region，PRR)，其中包含外顯子9(Exon 9)編碼的48個氨基酸，不僅參與細胞內信號轉導[9]，也與細胞增殖和分化密切相關[10]。Numb 4種主要亞型的產生就在于對Exon3和 Exon9的選擇性剪切，根據PTB和PRR結構域是否包含11個氨基酸片段和48個氨基酸片段，將Numb蛋白分為4個亞型：Numb1 (Nbp72)，擁有完整的PTB和PRR結構域(PTBL, PRRL)；Numb2 (Nbp66)，缺失PRR結構域(PRRS)；Numb3 (Nbp71)，缺失PTB結構域(PTBS)；Numb4 (Nbp65)，既缺失PTBS又缺失PRRS[11]。這些亞型在調節信號通路與細胞功能方面發揮著截然不同的作用，可能為疾病治療提供不同的分子靶點。

2 不同亞型Numb蛋白與肝纖維化的關系

目前Numb在肝纖維化中的研究尚少，其剪接變異的存在及其確切調控的生理相關性更是鮮為人知。有研究[12]認為，Numb可以促進纖維化肝臟的肝細胞再生，也有研究[13]發現微小RNA148a可顯著上調Numb的表達，減輕肝癌小鼠的肝纖維化程度，但其在抗肝纖維化效應中的具體機制尚不明確。在分子水平上，Numb參與調控Notch、Hedgehog和p53依賴的信號通路[14]，鑒于這幾條信號通路與肝纖維化的發生與發展關系密切[15]，以及Numb調控成體干細胞不對稱分裂的特性[16]，提示Numb有可能參與肝纖維化的病理進程。由于不同亞型的Numb蛋白具有不同的功能，因此，其在調節信號通路與細胞增殖分化上也有所區別。故Numb亞型-信號通路-肝纖維化這三者之間的關系值得進一步的研究和探討。

2.1 Numb亞型與Notch信號通路 Notch通路是一種保守的信號轉導級聯反應，近年來，Notch信號通路在肝纖維化發生中的作用及其機制受到廣泛關注。首先，HSC自身、肝實質細胞或其他非實質細胞的Notch信號活化都會激活HSC[17-18]，使其轉化為肌成纖維細胞，促進肝纖維化進展。其次，Notch信號通路激活可促進肝干細胞向膽管上皮細胞分化，促進膽汁淤積性肝纖維化的進展[19]。抑制Notch信號通路活化可抑制HSC活化以及肝纖維化進展[20]。提示探尋抑制Notch信號通路活化的手段可能有助于肝纖維化的防治。

Numb作為Notch信號通路的重要負向調控因子，在細胞分裂過程中，遺傳Numb的細胞缺乏Notch活性，從而決定子代細胞命運[21]，但Numb抑制Notch的確切機制尚不明確，可能通過內吞作用[22]、泛素化途徑、靶向Notch胞內結構域[23]或轉錄因子RBPJ-κ等[24]，且發現Numb亞型的切換可影響這一過程。有研究[25-26]發現，含有Exon9的Numb亞型表達增加卻促進了Notch信號活化，如在肺癌研究中，發現Numb2(PTBL/PRRS)表達增加可有效抑制Notch信號通路活化，但當與擁有Exon9編碼的PRR結構域的Numb1(PTBL/PRRL)拮抗后增加了Notch靶基因的表達[27]。除了Exon9，Exon3編碼的PTB結構域的存在與否與Notch活性密切相關。在PC12細胞中，與擁有PTB結構域的Numb亞型(Numb1和Numb2)相比，缺乏PTB結構域(Numb3和Numb4)表現出更高的Notch活性[28]，這可能與泛素化途徑相關。

近年來，大量研究[29]表明，Numb和Notch之間的生物拮抗作用主要依賴于泛素化。一方面，E3泛素連接酶LNX可靶向Numb引起Numb自身的泛素化和降解，從而降低了對Notch的抑制作用[30]。研究[31]表明，雖然Numb的4種亞型均能與E3泛素連接酶LNX結合，但只有Numb1(PTBL/PRRL)和Numb2(PTBL/PRRS)被泛素化及降解，其關鍵機制在于LNX的PDZ1結構域與PTB之間的相互作用。另一方面，E3泛素連接酶ITCH可引起Notch的泛素化，有研究[32]發現，刪除PTB結構域C端的88個氨基酸后，其泛素化Notch的能力大大下降，表明Notch信號通路的泛素化需要一個完整的PTB結構域與泛素連接酶結合。上述結果表明，含有PTB結構域的Numb亞型可抑制Notch信號的活性，而PRR結構域可能會破壞這種抑制機制。因此，基于Numb蛋白不同亞型與Notch信號通路的關系及Notch信號在肝纖維化發生發展過程中所起的作用，研究Numb蛋白亞型在肝纖維化中的作用是十分有意義的，這可能為靶向分子治療肝纖維化提供一個新方向。

2.2 Numb亞型與P53通路 P53作為一種典型的抑癌基因，可通過凋亡、細胞周期調控、細胞衰老等多種途徑發揮抗腫瘤作用[33]，目前也發現其對代謝相關脂肪性肝病[34]和肝纖維化[35]具有調控作用。其中在肝纖維化環境中可以調控HSC的活化與衰老[36]，可能與誘導細胞鐵死亡相關[37]。其缺失可使HSC的凋亡減少而導致廣泛的肝纖維化[36,38]；其上調可促進HSC衰老而降低纖維化程度[39]。而P53的穩定離不開Numb的支持[8]。

P53被E3泛素連接酶MDM2結合并泛素化，從而調控其蛋白酶體降解，而Numb可以通過Exon3編碼的11個氨基酸短鏈與MDM2的酸性域結合并抑制MDM2，從而穩定P53通路[8]。有研究[40]發現，敲除所有Numb亞型或只敲除Numb1/2可顯著降低P53的表達水平，而沉默Numb 3/4則沒有顯著影響，認為只有含有完整PTB結構域的Numb亞型才能阻止P53的泛素化和降解。因此，基于Numb1/2對P53的穩定作用，P53對HSC的促凋亡效應，各亞型Numb蛋白在肝纖維化的意義值得進一步探究。

2.3 Numb亞型與Hedgehog信號通路 Hedgehog途徑是一種復雜的、受嚴格調控的信號轉導途徑，可簡化為4個主要組件：Hedgehog配體、受體，信號轉換器和轉錄效應因子Gli[41]，在纖維化模型中，抑制Hedgehog信號通路可抑制HSC活化減輕肝纖維化[42]，而促進其表達則激活HSC[43]，并促進肝祖細胞向肌成纖維細胞分化進而加重肝纖維化的進展[44]。而該通路的抑制機制也有賴于Numb蛋白。

小干擾RNA (siRNA)介導的Numb敲除減少了內源性Gli1的泛素化[45]，其機制與Notch信號通路的泛素化途徑類似，Numb可通過結合E3泛素連接酶ITCH靶向Gli1，促進其泛素化，從而減少Hedgehog的表達[46]。如前所述，Numb與ITCH結合需要一個完整的PTB結構域，故帶有PTB結構域的Numb1與Numb2在抑制Hedgehog信號通路上可能具有更大貢獻。

3 Numb亞型對纖維化肝臟肝干細胞分化與增殖的潛在影響

干細胞是一類具有自我更新和向特定譜系分化潛能的細胞群，細胞對稱分裂和非對稱分裂是其特有的性征和再生的機制[47]。成體肝臟中存在可分化為肝細胞或膽管上皮細胞譜系的雙潛能干細胞，又稱之為內源性肝干細胞，在纖維化過程中其也可以分化為肌成纖維細胞[48]。故調控肝臟干細胞的增殖與分化可能為肝纖維化的治療提供更為理想的方案。

Numb具有不對稱分布和調控不對稱分裂的特性，從而調節胚胎和成年器官中干細胞及祖細胞的增殖、分化，決定干細胞命運和自我更新。與果蠅神經干細胞分化相似，早期有研究[49]發現，在小鼠神經系統發育過程中，也因為Numb的不對稱分裂，擁有Numb的子細胞可以抑制該子細胞的Notch活性從而誘導神經元分化。而在肝纖維化中，抑制Notch信號通路可以抑制肝干細胞向膽管細胞分化從而減輕纖維化程度[20]，且不同的亞型具有不同的功效。在癌癥研究中，PRRL促進癌干細胞的增殖而非分化，PRRS則促進其分化而非增殖[10]。如在肝細胞癌中，PRRL型Numb的表達高于PRRS型，促進了肝癌干細胞的增殖，導致預后不良[50]。目前尚未有Numb對肝干細胞不對稱分裂調節的直接證據，但可能具有潛在效應。

4 小結

綜上所述，Numb是一個重要的細胞命運決定子，因基因選擇性剪切Exon3或Exon9而主要產生4種亞型蛋白。盡管各亞型Numb蛋白與肝纖維化之間的關系尚未明確，但基于擁有的PTB結構域的Numb1或Numb2可能通過與不同E3泛素連接酶結合促進Notch、Hedgehog信號通路的泛素化，穩定P53信號通路，以及調控肝干細胞的分化取向等研究證據，提出合理展望：Numb1或Numb2可能可以抑制肝纖維化進展，但尚不清楚Numb3和Numb4是否會加重肝纖維化或不產生效果，因此圍繞Numb亞型探尋肝纖維化的潛在分子靶點是一個值得深入的新課題。簡言之，調控Numb選擇性剪切，或提高Exon3的表達，可能成為肝纖維化治療的潛在手段。

作者貢獻說明：許燕楠負責收集查閱文獻并撰寫論文；劉平負責修改論文；慕永平負責指導撰寫文章并最后定稿。