林木病原微生物鑒定及分類方法進展探究

孫 尚

（江西農業大學林學院，江西 南昌 330045）

1.國內外病原微生物研究進展

植物病害會對林業產生一定的危害，例如造成板栗疫病、歐美楊細菌潰瘍病、柑橘黃龍病等森林病害，對林業造成重大的經濟損失。植物病害常見的有侵染性病害和非侵染性病害，非侵染性病害由非侵染性病害(環境)因素引起的病害；侵染性病害是由生物性病原引起的病害，生物性病害病原可分為真菌性、細菌性、病毒性和螨類等。

傳統分類鑒定方法的相關研究一般依照柯赫式法則，通常是先取病葉通過組織分離法獲取病原微生物，通過查閱文獻資料進行分類鑒定，后通過回接試驗引起寄主植物發病，而后將再分離出的微生物與接種微生物比較。這種方法是植物病理學上的經典，沿用至今。如黃澤余等對廣西紅樹林真菌病害區系進行研究，發現病原真菌引起的葉部病害是紅樹林的主要病害。費顯偉等對李樹細菌性穿孔病進行病原鑒定，發現病原物為一種革蘭氏陰性細菌。

隨著現代分子生物學技術的發展，新的技術在病原菌鑒定方面表現出較高的應用價值。如隨機擴增多態性DNA技術，制性片段長度多態性(RFLP)技術，實時熒光定量PCR技術的應用，為病原鑒定提供了提供了可靠手段。比如，劉鵬等根據病原菌的核糖體DNA 16 S-23 S區域設計特異性引物，應用16S rDNA PCR定量快速準確地檢測到蝴蝶蘭軟腐病原，該方法較傳統的PCR靈敏度高100倍；Guglielmo等利用多重 PCR，針對不同屬立木腐朽菌設計特異性引物，共鑒定了11屬的立木腐朽菌。

病原微生物的致病性試驗作為柯赫式法則的重要一步分，也經歷著不斷發展。如今，對寄主植物回接的主要方式有穿刺接種法、打孔接種法、噴霧法接種、離體葉片接種法等。通過對寄主植物發病癥狀和發病程度的觀察，可以證明病源微生物的致病性。于磊等成功分離出桉樹潰瘍病病原菌并在桉樹幼苗上得以檢驗；葉青靜等通過苗期噴霧法接種和離體葉片接種法對番茄灰葉斑病原菌進行反接實驗，驗證了病原菌的致病性。

2.細菌分類研究進程

細菌分類工作主要包括細菌分離，鑒定，描述，命名，保藏。最小的細菌長度僅有0.2nm，由于細菌個體過小，直到17世紀細菌才第一次在顯微鏡下露出它本來面目。至此人們開始對形態各異的細菌進行分類，而雙名法的出現使得細菌的命名得以規范。在1970年的第十屆國際微生物學大會上發布的《國際細菌命名法規》，為細菌命名制定了統一的標準。《法規》認為細菌新名稱需要在國際系統進化微生物學雜志上發表方可算是合格的發表。

第一個使用雙名法并建立細菌分類系統的是Ferdinand Cohn。丹麥科學家orla-jensen和荷蘭科學家Kluyver在進行細菌分類研究中引入了細菌生理特征指標，接著，科學家們發現不同細菌的生化性狀也具有特異性，如血清反應等，于是生化指標也成為用于細菌分類鑒定的工具。生理生化指標和形態特征共同用于細菌分類鑒定，使細菌分類方法得到完善，并極大的推動了細菌分類工作的發展。由于生理、生化特征指標容易受到某些主觀因素的影響，細菌的分類需要引入其他手段。

因此數值分類法應運而生，最早采用此方法的是sneath，將信息技術引入細菌鑒定，開發出新的細菌分類系統—數值分類用于細分類鑒定，如核酸分析，DNADNA雜交，DNA-rRNA雜交等，這些以待測菌株的遺傳信息為基礎進行分類的指標使得細菌分類更為準確。這些分子手段使得細菌鑒定的途徑更加豐富，而產生于1986年的基因組學更是在發掘新基因，揭示非編碼功能序列及研究物質進化史等方面發揮著重要作用。

由于微生物基因組比較小，研究起來難度也更小一些，所以基因組的研究最早是從微生物開始的。世界上第一個進行全基因組測序的微生物是流感嗜血桿菌于1995年被測序，模式生物大腸桿菌)的全基因組序列于1997年被測定。而在我國，第一個由我國自主測序得到的全基因組序列是在2002年由北京華大基因研發中心利用WGS的方法測序和組裝得到的騰沖嗜熱厭氧菌。這比世界上第一株進行全基因組測序的細菌要晚七年，但是近年來隨著我國在微生物方面投入加大，我國微生物的科研也得到了快速發展，越來越多的微生物進行了全基因組測序.隨著這些微生物完成了全基因組的測序的工作，這也表明我國在微生物基因組領域得到了快速的發展。

隨著物理技術研究的深入，氣相色譜，液相色譜也開始應用于細菌分類研究中，一些化學分析指標也被運用于細菌分類鑒定中，如急性脂、呼吸醌、脂肪酸的成分及含量，肽聚糖，胞壁酸和細胞壁糖成分分析等。這些跨學科的新方法完善了細菌分類鑒定技術，對于那些使用生理，生化性狀無法鑒定的物種有了新的研究方法。

到了現代，細菌分類已經進入了多相分類的發展階段，綜合多種方法對待測菌株的分類地位進行科學研究，從形態特點，生理生化性狀再到分子手段，化學成分分析等多個層面對細菌的各種性狀分析，建立細菌的多相分類系統，力求合理的展示細菌之間的親緣關系。

3.真菌分類研究進程

真菌的分類系統依然使用雙名法對新物種命名。真菌的傳統分類方法主要是以形態和生理化特征為依據，通過對細胞形態、大小、排列、運動性、特殊構造和染色反應及菌落形態以及在培養基中的生長狀態，來鑒定該菌株的屬種。形態特征是細胞內部基因與外界環境因素共同作用的結果，由于受到環境因子的影響，形態學鑒定結果往往是不準確的。這時分子生物學技術的發展，為真菌分類鑒定開辟了新途徑。通過対DNA堿基組成的摩爾百分比例的探究，是早期運用于真菌進行分類鑒定的分子手段。由于該方法只能測定到綱，所以需要其他方法對真菌鑒定進行補充。現如今，核糖體脫氧核酸(rDNA)序列測定、DNA分子雜交技術、線粒體DNA限制性片段多態性(RFLP)分析 ，隨機擴增多態性分析(RAPD)技術等方法的應用，使得真菌分類研究變得操作簡便、準確和可靠。

4.林木病原微生物鑒定及分類方法展望

自從1665 年列文虎克發明第一個顯微鏡，使人們來到了微生物的世界。而1882年柯赫氏法則，讓人類擁有了與植物病害打交道的手段。在長達百年的發展中，尤其是分子技術的出現，讓林木病原微生物鑒定手段越來越豐富。如今，全基因組測序，看家基因分析，多基因序列分析，多重pcr檢測技術層出不窮，讓微生物分類在分子層面上有了更多的解釋方法；而隨著電子顯微鏡的出現，也讓很多微觀結構成為微生物形態學分類的重要指標。隨著工業科技的不斷提升，微生物的分類界限也將愈加清晰，森林病原微生物的鑒定手段也更加方便快捷。