紙橋法液體培養基替代瓊脂固體培養基用于食用菌菌種培養的初步探索

栗志

摘? ? 要：本文設計了一種使用紙橋法培養常見食用菌菌種（平菇、香菇、金針菇）的方案，并通過試驗得出如下結論：相對于瓊脂固體培養基，平菇、香菇、金針菇的菌絲體在紙橋法液體培養基上均表現出更高的生長速率，而且紙橋法液體培養基在營養物質傳質速率方面存在顯著的優勢，尤其適用于試驗教學，是瓊脂固體培養基的良好替代品。

關鍵詞：紙橋法;液體培養基;菌種培養

文章編號：1005-2690（2021）20-0017-02? ? ? ?中國圖書分類號：S646? ? ? ?文獻標志碼：B

紙橋法是傳統上用于植物組織培養的一種技術[1]，由于植物培養物對礦物鹽濃度較為敏感，瓊脂中額外的礦物質可能對植物培養物產生影響，故采用無灰濾紙制作的紙橋來確保培養物在不受到額外礦物質影響的情況下，也能夠給同時得到充分的氧氣、水分和營養物質供應[2]，另有原理和紙橋法類似的培養床網絨纖維用于愈傷組織液體培養基的傳質[3]。

實驗室規模的食用菌菌種培養一般采用PDA瓊脂固體培養基，相對于植物固體培養基的瓊脂濃度（一般低于1%），真菌固體培養基的瓊脂濃度（一般為2%）要高得多。瓊脂濃度越高，其分子構筑起的三維網狀凝膠結構的強度越大，這有助于固體培養基保持一定的強度和形狀，但也對培養基中營養物質的遷移速率（即傳質速率）存在影響。以PDA培養基中的主要碳源和能源——葡萄糖為例，研究表明，瓊脂濃度的升高會造成葡萄糖的遷移速率減慢[4]。另有研究者發現由于存在傳質阻力，瓊脂濃度的增加會造成木葡糖酸醋桿菌的葡萄糖利用率、菌體量和細菌纖維素產量下降[5]。

嘗試用無灰濾紙制造的紙橋進行實驗室規模食用菌菌種培育，和相同營養成分的瓊脂固體培養基進行對照。根據菌種的生長速率和培養基中可溶性固形物（對應營養物質）的濃度變化來對比兩者培養方法的優劣。

選用食用菌均為常見物種，即平菇、香菇、金針菇。

1? ?試驗準備

1.1? ?試驗材料

平菇（Pleurotus ostreatus）純培養菌種，品系為高郵3號;香菇（Lentinus edodes）純培養菌種，品系為L808;金針菇（Flammulina? velutiper）純培養菌種，品系為245號。

1.2? ?試驗設備及試劑

設備：人工氣候箱、干燥箱、高壓滅菌鍋、微孔濾膜透氣蓋和配套的螺口方玻璃瓶、解剖刀、鑷子、燒杯、量筒、電子天平、稱量紙、酒精燈、超凈工作臺、無灰濾紙。

試劑：新鮮的馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDA）、去離子水、瓊脂粉。

2? ?試驗過程

將微孔濾膜透氣蓋和配套的螺口方玻璃瓶（橫截面積約為80 cm2）依照如下規則進行分組編號并處理。

瓊脂試驗組：加入螺口方瓶總容積1/4體積的PDA液體培養基和液體培養基重量2%的瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻凝固后分別接種香菇純培養菌種、平菇純培養菌種、金針菇純培養菌種，每個菌種接種不少于4瓶，25 ℃、70%濕度黑暗培養。

紙橋試驗組：加入螺口方瓶總容積1/4體積的PDA液體培養基和無灰濾紙制造的紙橋，紙橋上表面盡可能和螺口方瓶橫截面大小、形狀一致，液面高度超過紙橋高度的2/3，保證整個紙橋被液體培養基所浸潤，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至常溫后分別接種香菇純培養菌種、平菇純培養菌種、金針菇純培養菌種，每個菌種接種不少于4瓶，25 ℃、70%濕度黑暗培養。

瓊脂對照組：加入組培瓶總容積1/4體積的PDA液體培養基和液體培養基重量2%的瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻凝固后置于25 ℃、70%濕度黑暗條件下。

紙橋對照組：加入螺口方瓶總容積1/4體積的PDA液體培養基和無灰濾紙制造的紙橋，液面高度超過紙橋高度的2/3，保證整個紙橋被液體培養基所浸潤，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至常溫后置于25 ℃、70%濕度黑暗條件下。

瓊脂空白組：加入組培瓶總容積1/4體積的去離子水和液體重量2%的瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻凝固后置于25 ℃、70%濕度黑暗條件下。

試驗過程中保持較高的濕度，一是模擬菌絲體最適宜生長的環境，二是通過提高水蒸氣分壓來減少培養基水分蒸發引起的誤差。瓊脂空白組的存在意義在于抵消瓊脂凝膠上層、下層瓊脂濃度不同造成的誤差。

每3 d記錄菌絲體在瓊脂試驗組和紙橋試驗組培養基上的生長狀況，30 d后對培養基取樣，在110 ℃干燥箱烘干至恒重，根據烘干后重量和烘干前重量的比值，計算出瓊脂試驗組、瓊脂對照組、瓊脂空白組上半層、下半層，以及紙橋試驗組和紙橋對照組液體培養基表層和深層的可溶性固形物含量。

3? ?試驗結果

3.1? ?菌絲體生長速率量化分析

對培養物進行拍照，將照片上紙橋上表面和瓊脂固體培養基表面劃分為5×5的25個小方格，最初接種的菌絲體大小控制在一個小方格左右，隨著時間推移，菌絲體不斷生長、擴散，覆蓋了越來越多的面積。利用小方格對菌絲體覆蓋面積進行計數，接近或略多于一個小方格全部面積的計為4%，接近或略多于一個小方格1/2面積的記為2%，覆蓋極少或根本沒有覆蓋一個小方格面積的記為0%。對菌絲體所占小方格的數量進行累加，即可判斷菌絲體的大小和生長速率。

經過實測得到的3種食用菌菌絲體在紙橋和瓊脂表面的生長曲線（試驗組取平均值），其斜率即為生長速率，如圖1所示。

3.2? ?可溶性固形物含量分析

由于瓊脂培養基中的可溶性固形物數據包含瓊脂，所以需要將瓊脂空白組的可溶性固形物含量減去再作為有效數據。紙橋法有少量菌絲體蔓延到溶液中形成懸液，所以取樣后先過濾除去菌絲體再進行測定。

根據實測數據做出的30 d后平菇、香菇、金針菇培養基上（表）層/下（深）層可溶性固形物含量對比（試驗組取平均值，單位為%）結果如下。

瓊脂對照組：2.51/2.53，平菇瓊脂培養基：1.24/ 2.03，香菇瓊脂培養基：1.44/2.23，金針菇瓊脂培養基：1.34/2.09;紙橋法對照組：2.57/2.58，平菇紙橋法：1.56/1.58，香菇紙橋法：1.71/1.72，金針菇紙橋法：1.66/1.67。

4? ?結論與分析

平菇、香菇、金針菇菌絲體在紙橋法液體培養基上的生長速率普遍高于各自在瓊脂固體培養基上的生長速率，即菌絲體需要較短的時間即可占領同樣面積的培養基，這種特性適合在實驗室中進行教學，學生可以在較短的時間內完成食用菌菌種培養的全過程。

平菇、香菇、金針菇菌種接種30 d后，瓊脂培養基上半部分的可溶性固形物（不包括瓊脂）含量顯著低于瓊脂固體培養基下半部分的可溶性固形物（不包括瓊脂）含量，而紙橋法液體培養基表層和深層的可溶性固形物含量十分接近，這一現象很好地表述出固體培養基在營養物質遷移速率上與液體培養基存在差距。用紙橋法培育食用菌菌種可以充分利用液體培養基中營養物質較高的遷移速率，讓菌絲體得到更為充足的營養供應，不容易出現短缺現象，這可能是其表現出更高生長速率的原因之一。

紙橋法液體培養基為菌種培養提供了一條有效的新思路，但其具體參數的優化，以及在規模上如何進一步擴大，從試驗室走向生產，仍需要更多的研究工作。

參考文獻：

[1]于德才，李學湛，呂典秋，等.紙橋法培育馬鈴薯脫毒試管苗壯苗技術初探[A]. 中國作物學會馬鈴薯專業委員會.2005年全國馬鈴薯產業學術年會論文集[C].中國作物學會馬鈴薯專業委員會：中國作物學會馬鈴薯專業委員會，2005：2.

[2]安利國，楊桂文.細胞工程（3版）[M].北京：科學出版社，2015.

[3]周春長.影響植物纖維模擬生物反應器滲透浸潤傳質MS培養液過程的因素[D].吉首：吉首大學，2020.

[4]邊界，何田，葉微針，等.葡萄糖在瓊脂凝膠中的遷移速率[J].廣東化工，2021，48（7）：50-51.

[5]謝永振.靜置培養過程中瓊脂濃度對細菌纖維素合成的影響[D].天津：天津科技大學，2018.

（編輯：郝煥霞）