不同濃度6-BA對(duì)銀杏莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響

趙軍

摘? ? 要：本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，采用1.5 mg/L、1.7 mg/L、2.1 mg/L、2.4 mg/L 4種不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)銀杏莖段進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)。結(jié)果表明，當(dāng)IBA固定為0.2 mg/L時(shí)，6-BA取1.7 mg/L誘導(dǎo)率最高，達(dá)93.3%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)4月中旬取材的污染率最低，為最佳取材時(shí)間。

關(guān)鍵詞：銀杏;莖段;6-BA ;叢生芽

文章編號(hào)：1005-2690（2021）20-0013-02? ? ? ?中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：S792.95? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

銀杏是最古老的孑遺植物，裸子植物屬銀杏科現(xiàn)存唯一的種類，被我國(guó)列為二級(jí)保護(hù)植物。銀杏生長(zhǎng)在水熱條件比較優(yōu)越的亞熱帶季風(fēng)區(qū)，適合于pH值為5～6的黃壤或黃棕壤，在第四紀(jì)冰川后，僅留于中國(guó)，后傳入日本、韓國(guó)、加拿大等國(guó)家，目前主要分布在中國(guó)的溫帶和亞熱帶氣候區(qū)，遍及我國(guó)22個(gè)省（自治區(qū)），其中主要在四川、貴州等省份，較為珍稀[1]。

銀杏樹(shù)俊俏雄奇，葉呈扇型似鵝掌，奇特古雅，對(duì)煙塵、二氧化硫有特別的抵抗力，抗污能力強(qiáng)，適應(yīng)性強(qiáng)，可做農(nóng)田防護(hù)林、護(hù)路林;銀杏葉可入藥，從銀杏葉中能夠提取150多種化合物，如銀杏黃酮、雙黃酮和銀杏內(nèi)酯對(duì)心腦血管疾病具有獨(dú)特功效[2-4]。

隨著銀杏利用價(jià)值的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，銀杏種植已經(jīng)成為一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)生態(tài)效益雙高的產(chǎn)業(yè)，一些優(yōu)良品種已大面積推廣。但銀杏是雌雄異株植物，以傳統(tǒng)種子、扦插、嫁接進(jìn)行繁殖效率較低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，不能滿足市場(chǎng)需求。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行銀杏快繁，可以提高成活率，并保持品種原有的優(yōu)良性狀[5]。

目前對(duì)銀杏的組織培養(yǎng)已有一定的研究，自20世紀(jì)30年代以來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后開(kāi)展了銀杏胚胎培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)等研究。銀杏組織快繁培養(yǎng)多以莖段為外植體誘導(dǎo)出叢生芽，如陳穎、曹福亮發(fā)現(xiàn)莖段可誘導(dǎo)出叢生芽，張祖榮用莖段培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)6-BA為2.0 mg/L時(shí)叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)81%。多數(shù)莖段培養(yǎng)生長(zhǎng)素范圍為0.2～0.5 mg/L，而細(xì)胞分裂素取值范圍比較大。本試驗(yàn)分別取1.5 mg/L、1.7 mg/、2.1 mg/L、2.4 mg/L 4個(gè)水平的6-BA濃度，探討當(dāng)IBA=0.2 mg/L時(shí)不同的6-BA濃度對(duì)銀杏莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響，同時(shí)探討不同的取材時(shí)間對(duì)銀杏組織培養(yǎng)污染的影響，以期滿足市場(chǎng)的各種需求。

1? ?試驗(yàn)材料與方法

材料取自于四川宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)無(wú)病蟲(chóng)害幼嫩健壯的銀杏枝條。

1.1? ?不同6-BA濃度設(shè)計(jì)

將銀杏幼嫩莖段在清水中洗凈，于自來(lái)水下沖洗30 min，瀝干水分，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒，再用0.1%升汞消毒，無(wú)菌水沖洗后將莖段切割成1.0～1.5 cm帶腋芽的小段，接種在以MS+IBA0.2 mg/L為基本培養(yǎng)基，添加有4種不同濃度6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，pH值調(diào)至5.8。共計(jì)4個(gè)處理480瓶，設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.2? ?取材時(shí)間對(duì)污染影響設(shè)計(jì)

銀杏一般在3月下旬至4月上旬萌動(dòng)展葉，4—5月為進(jìn)行組織培養(yǎng)較適宜取材時(shí)間。為探究取材時(shí)間對(duì)污染的影響，在4月1日、4月15日、5月1日、5月15日取銀杏莖段進(jìn)行相同的消毒處理，接種于MS培養(yǎng)基上，共計(jì)4個(gè)處理480瓶，設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

以上均置于（25±2） ℃，每天以1 000～2 000 lx光照12 h后進(jìn)行培養(yǎng)。接種后觀察生長(zhǎng)狀況、叢生芽誘導(dǎo)情況、高度、污染、褐變情況。

誘導(dǎo)率=未污染叢生芽個(gè)數(shù)/未污染接種外植體個(gè)數(shù)×100%? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （1）

污染率=污染瓶數(shù)/接種瓶數(shù)×100%? ? ? ? ? ? ? ?（2）

褐變率=未污染褐變瓶數(shù)/未污染接種外植體數(shù)×100%? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （3）

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同6-BA濃度對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)

接種7 d后外植體開(kāi)始有生長(zhǎng)跡象，出現(xiàn)嫩綠色的生長(zhǎng)點(diǎn)，15 d左右莖段開(kāi)始伸長(zhǎng)，由黃綠變?yōu)榇渚G，腋芽開(kāi)始萌動(dòng)變綠，周圍幼嫩苞片慢慢散開(kāi)呈星狀，中心生長(zhǎng)點(diǎn)凸起。試驗(yàn)20 d后1號(hào)處理開(kāi)始出現(xiàn)翠綠呈五星狀的不定芽，其周圍的葉片開(kāi)始向四周生展。35 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在IBA用量恒定時(shí)，不同濃度的6-BA對(duì)銀杏叢生芽的誘導(dǎo)有較大影響，隨著6-BA濃度升高，叢生芽誘導(dǎo)開(kāi)始增加。當(dāng)6-BA為1.7 mg/L時(shí)，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)93.3%，但6-BA濃度再增大誘導(dǎo)率會(huì)出現(xiàn)下降，6-BA2.4 mg/L時(shí)叢生芽誘導(dǎo)率最低為23.3%。

6-BA濃度變化對(duì)叢生芽長(zhǎng)勢(shì)有一定影響，隨著6-BA濃度增大，叢生芽從翠綠變嫩綠，當(dāng)6-BA為2.4 mg/L時(shí)叢生芽有玻璃化趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)分析說(shuō)明，當(dāng)IBA=0.2 mg/L時(shí)，試驗(yàn)范圍內(nèi)6-BA濃度1.7 mg/L叢生芽生長(zhǎng)最好，極顯著優(yōu)于處理1、3、4。試驗(yàn)中6-BA濃度變化對(duì)銀杏再生體系的褐變和高度沒(méi)有影響。

2.2? ?不同取材時(shí)間的污染影響

試驗(yàn)的污染多在接種培養(yǎng)2～5 d后開(kāi)始出現(xiàn)，表現(xiàn)為培養(yǎng)基表面出現(xiàn)黏狀細(xì)菌菌斑和黑色、灰色毛狀真菌菌斑，培養(yǎng)15 d后的污染情況結(jié)果見(jiàn)表4。

結(jié)果顯示，4月15日取材時(shí)污染率最小為5.00%，5月15日污染率最大為44.16%。統(tǒng)計(jì)分析表明，4月15日取材極顯著優(yōu)于其余各取材時(shí)間。

3? ?討論

3.1? ?6-BA對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)

叢生芽是由植物器官和愈傷組織發(fā)育出來(lái)的群體叢生芽苗，試驗(yàn)以銀杏莖段離體培養(yǎng)誘導(dǎo)叢生芽，其中使用了生長(zhǎng)素IBA（吲哚丁酸）和細(xì)胞分裂素 6-BA（6-芐基腺嘌呤）兩種激素。在植物組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有誘導(dǎo)分化作用，完整植株的形態(tài)建成就是它們共同作用調(diào)控的，兩種激素配合使用時(shí)其比值能調(diào)節(jié)分化方向。

在本次試驗(yàn)中生長(zhǎng)素IBA不變?yōu)?.2 mg/L時(shí)，6-BA為1.7 mg/L時(shí)叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)93.31%，叢生芽翠綠健壯，說(shuō)明當(dāng)生長(zhǎng)素保持恒定不變時(shí)，增加細(xì)胞分裂素的濃度有利于芽的分化，但過(guò)高試管苗有玻璃化趨勢(shì)。

3.2? ?不同取材時(shí)間對(duì)污染情況的影響

污染是指在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基或培養(yǎng)材料上滋生細(xì)菌、真菌等微生物，出現(xiàn)培養(yǎng)材料不能正常生長(zhǎng)發(fā)育的現(xiàn)象。造成污染的原因主要是培養(yǎng)基和器具滅菌不徹底、接種操作不規(guī)范等，同時(shí)外植體帶菌是造成污染的重要原因，外植體是否染菌、染菌多少與取材時(shí)間有很大關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，在規(guī)范操作的情況下，銀杏離體培養(yǎng)污染率與取材時(shí)間有很大關(guān)系，在銀杏可以取材的時(shí)間范圍內(nèi)，以4月15日為最優(yōu)，隨著取材時(shí)間向后推移污染率逐漸增大。

3.3? ?褐變問(wèn)題

褐變是由于植物體內(nèi)的酚類化合物被多酚類氧化酶催化，使酚類化合物被氧化成褐色的醌類化合物而形成的。有資料顯示，銀杏細(xì)胞離體培養(yǎng)褐變嚴(yán)重，本次銀杏莖段離體培養(yǎng)試驗(yàn)無(wú)褐變現(xiàn)象，這可能與銀杏取材時(shí)間較早取材部位較嫩、酚類次生代謝物累積較少有關(guān)。

4? ?結(jié)論

以帶腋芽的銀杏幼嫩莖段為外植體，在MS+IBA

0.2 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，梯度添加1.5～2.4 mg/L的6-BA，在試驗(yàn)范圍內(nèi)以6-BA1.7 mg/L叢生芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)93.3%，為最適濃度。

參考文獻(xiàn)：

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