凍融單囊胚移植周期中囊胚形成時間對臨床結局的影響

黃亞，徐利，葛鳳菊，祁秀娟，高曉艷

(上海永遠幸婦科醫院，上海 200131)

隨著輔助生殖技術和玻璃化冷凍技術的發展，凍融單胚胎移植被越來越多的生殖中心所接受，尤其是凍融單囊胚移植，由于囊胚的發育潛能更佳、與內膜的同步性更好，移植成功率更高而備受關注[1-3]。但是人類胚胎在早期發育過程中，囊胚的形成時間并不一致，每一枚囊胚的質量也不盡相同，如何選擇發育潛力最好的囊胚成為關鍵。而關于囊胚的形成時間，大多數生殖中心都是以發育天數為單位，一般以D5和D6囊胚為主，D7囊胚因質量較差被大多數生殖中心所廢棄。本文將囊胚形成時間細化到小時，探討囊胚形成時間對單囊胚FET周期妊娠結局的影響，同時結合囊胚質量，分析在囊胚質量不同的情況下，囊胚形成時間對臨床結局的影響，以期為單囊胚FET選擇策略提供依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1月至2020年7月在我院生殖中心接受單囊胚FET的815個周期的臨床資料。納入標準：移植復蘇后擴張的D5、D6、D7囊胚的單囊胚FET周期。排除標準：反復種植失敗、子宮畸形、有宮腔病變、女方年齡>44歲以及失訪的患者等。

二、研究方法

1.囊胚培養與評分：患者取卵日為第0天(D0)，第1天(D1)觀察到雙原核為正常受精，培養至第3天(D3)時將胚胎轉移至囊胚培養液中，繼續觀察至第5～7天，根據囊胚形態及直徑來決定是否進行冷凍。囊胚評分結合Gardner評分標準[4]及中華醫學會專家指南共識：內細胞團(ICM)形態規則、大小均勻、融合且直徑≥60 μm為A級；ICM形態不規則、大小不均、部分融合但直徑≥60 μm為B級；ICM明顯小于正常大小且細胞球數目極少為C級。滋養層細胞(TE)大小均勻、形態清晰且數目超過10個為A級；TE大小不均勻、部分形態清晰且細胞數目10個左右為B級；TE大小明顯不均勻、形態不清晰、數目少于10個為C級。

2.分組：我中心觀察囊胚時間一般為D5、D6和D7上午8：00左右，根據囊胚形成時間分為五組：≤118 h組(D5上午，306個周期)，(119～129)h組(D5下午，160個周期)，(130～142)h組(D6上午，264個周期)，(143～153)h組(D6下午，55個周期)，>153 h組(D7，30個周期)。如D5和D6囊胚直徑≥160 μm或者D7囊胚直徑≥180 μm，則進行冷凍；如D5和D6上午囊胚發育至2/3期，則于當天下午再次觀察囊胚發育情況，達到冷凍標準則進行冷凍，并記錄所有胚胎自授精之時起至達到冷凍標準時的發育時間。D7囊胚直徑未達到180 μm則予以廢棄。AA～CC所有符合直徑標準的囊胚均采用玻璃化冷凍技術進行冷凍，冷凍的囊胚均為完全擴張期囊胚。將冷凍的囊胚細分為高質量囊胚組(G1，AA/AB/BA/BB)、普通囊胚組(G2，AC/CA/BC/CB)和低質量囊胚組(G3，CC)。

3.囊胚冷凍方法：囊胚冷凍前均進行激光輔助孵化皺縮。操作方法根據試劑盒(KITAZATO，日本)的標準操作程序，關閉操作臺溫度，待囊胚皺縮后放置ES液中，靜置不超過15 min，再轉入VS液中，混勻洗滌數次，90 s內放置在冷凍載桿的前端，迅速投入液氮中，套上套管，于液氮中保存。

4.囊胚解凍方法：收到臨床醫生通知后方可解凍。操作方法根據試劑盒(KITAZATO，日本)的標準操作程序，解凍前關閉操作臺面溫度，將裝有囊胚的載桿從液氮迅速放入提前37℃預熱的TS液中計時1 min，轉入DS液中計時3 min，轉入WS1液中計時5 min，WS2液中自然沉降兩次后轉入已經平衡好的囊胚培養皿中。激光輔助孵化，將囊胚透明帶進行脫除，三氣培養箱中培養至少3 h，待囊胚擴張后進行移植。

5.凍融囊胚移植：采用人工周期和自然周期準備內膜。(1)人工周期內膜準備方案：月經第3天開始口服雌二醇地屈孕酮片(芬嗎通，雅培，荷蘭)紅片2 mg，3次/d，連服12 d；經陰道B超監測內膜厚度達到8 mm以上開始轉化內膜，轉化當天計為D0，開始口服雌二醇地屈孕酮片(芬嗎通，雅培，荷蘭)黃片2 mg，2次/d；D1開始同時黃體酮軟膠囊(安琪坦，Besins，比利時)200 mg陰道用藥，D5進行囊胚移植。(2)自然周期內膜準備方案：排卵日當天計為D0，D0開始口服地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)10 mg，3次/d，D5進行囊胚移植。移植后10 d查血βHCG。移植后4周進行B超檢查，子宮腔內見孕囊或原始心管搏動為臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期總數×100%；活產率=活產周期數/移植周期總數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、患者基礎資料及不同發育時間囊胚妊娠結局比較

共納入815個FET周期，患者平均年齡(34.23±4.81)歲，臨床妊娠率47.48%(387/815)，活產率36.93%(301/815)。各組間基本資料(平均年齡、BMI、不孕年限、基礎FSH、移植日內膜厚度和周期方案)比較均無顯著差異(P>0.05)。≤118 h組的臨床妊娠率和活產率均顯著高于其他四組(P<0.05)；(119～129)h組的臨床妊娠率和活產率與(130～142)h組均無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于(143～153)h和>153 h組的臨床妊娠率和活產率(P<0.05)；(143～153)h組和>153 h組的臨床妊娠率和活產率無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者基礎資料及不同發育時間囊胚妊娠結局比較

二、不同級別不同發育時間囊胚的妊娠結局比較

根據囊胚級別，分為三個亞組，分析不同級別囊胚中發育時間對妊娠結局的比較。

1.高質量囊胚組(G1)不同發育時間囊胚的妊娠結局分析：G1組內各囊胚不同發育時間組間患者的基本資料(平均年齡、不孕年限、基礎FSH、移植日內膜厚度)比較均無顯著性差異(P>0.05)。≤118 h組的臨床妊娠率顯著高于(119～129)h組和(130～142)h組(P<0.05)，其他4組間臨床妊娠率無顯著差異(P>0.05)。各囊胚不同發育時間組間的活產率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同質量囊胚內不同發育時間結局比較

2.普通囊胚組(G2)不同發育時間囊胚的妊娠結局分析：G2組內各囊胚不同發育時間組間患者的基本資料(平均年齡、不孕年限、基礎FSH、移植日內膜厚度)比較均無顯著性差異(P>0.05)。各囊胚不同發育時間組間的臨床妊娠率和活產率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

3.低質量囊胚組(G3)不同發育時間囊胚的妊娠結局分析：G3組內各囊胚不同發育時間組間患者的基本資料(平均年齡、不孕年限、基礎FSH、移植日內膜厚度)比較均無顯著性差異(P>0.05)。≤118 h組的臨床妊娠率顯著高于(130～142)h組、(143～153)h組和>153 h組(P<0.05)，與(119～129)h組無顯著性差異(P>0.05)，后3個發育時間段組間妊娠率均無顯著性差異(P>0.05)；≤118 h組的活產率顯著高于(143～153)h組和>153 h組(P<0.05)，除≤118 h組外其他4組間的活產率均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

討 論

在凍融單囊胚FET周期中，囊胚形成時間是否會影響妊娠結局仍存在爭議。多個研究結果顯示，D5囊胚臨床妊娠結局顯著優于D6囊胚[5-8]。Wang等[9]認為，D5囊胚的植入率、臨床妊娠率和活產率均顯著高于D6囊胚，但在新生兒出生體重、出生體長、低出生體重發生率和性別比等方面，D5組和D6組間差異無統計學意義(P>0.05)。本研究將囊胚形成時間進行細化，分析后發現同樣是D5形成的囊胚，D5上午囊胚(≤118 h組)的臨床妊娠率和活產率最高，并顯著高于其他4組(P<0.05)，而D5下午(119～129 h組)形成的囊胚與D6上午(130～142 h組)形成的囊胚其臨床妊娠率和活產率均無顯著差異(P>0.05)，D6下午(143～153 h組)形成的囊胚與D7(>153 h組)形成的囊胚其臨床妊娠率和活產率亦無顯著差異(P>0.05)。

在過去，D6未達到囊胚冷凍標準的胚胎都會被廢棄。而越來越多的研究表明，D7形成的囊胚也具有一定的臨床應用價值[10-12]。Ueno等[13]首次提出了D7囊胚冷凍標準，即直徑達到180 μm即可冷凍，其妊娠結局顯著高于移植D2胚胎的結局。本中心根據其提出來的冷凍標準，對D7直徑達到180 μm及以上的囊胚進行冷凍，并在適宜條件下進行凍融移植。結果表明，D7囊胚(>153 h組)的臨床妊娠率和活產率分別為23.33%(7/30)和16.67%(5/30)，與Ueno等[13]的研究結果類似，達到了可接受的臨床結局。

低質量囊胚(CC級)因質量較差而被大多數生殖中心所廢棄[14-15]，但是Li等[16]研究發現，移植CC級囊胚的臨床妊娠率仍在可接受范圍內，且新生兒結局與4BB級囊胚沒有顯著差異(P>0.05)。本中心研究表明，CC級囊胚依然有較大的臨床應用價值[17]。因此本研究將CC級囊胚也納入進來，結果發現：雖然低質量囊胚組中，隨著囊胚形成時間的延長，臨床妊娠率和活產率均呈現逐漸下降的趨勢，但總的我院4CC級囊胚也達到了可接受的臨床妊娠率為44.0%(45/171)，活產率為18.13%(31/171)。

研究發現，雖然D5囊胚臨床妊娠率和活產率明顯高于D6囊胚[18]，但優質囊胚在D5和D6移植的發育潛力是相當的[19-20]。當移植囊胚為非優胚時，囊胚形成時間對妊娠結局有顯著影響，D5囊胚移植妊娠結局優于 D6囊胚[15，21]，本研究結果與之類似。

Zhang等[22]研究發現，優質囊胚組中D5囊胚的臨床妊娠率和持續妊娠率顯著高于D6囊胚，而非優質囊胚組則無顯著性差異(P>0.05)。閆雪等[23]研究發現，移植D5和D6囊胚可達到相同的生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率及活產率。王雪等[24]研究發現，D5囊胚臨床妊娠率顯著高于D6囊胚，但是種植率和活產率沒有顯著性差異(P>0.05)。造成以上情況的原因可能是不同研究之間樣本量有差異以及囊胚形成時間沒有進一步細分。

本研究中，冷凍時間≤118 h組的囊胚臨床結局最好，顯著高于其他延遲發育的囊胚組。但是將囊胚按質量分組后，發現高質量囊胚組和普通囊胚組中，囊胚形成時間對活產率的影響并不大，而低質量囊胚組中≤118 h組的囊胚臨床結局最好，因此在單囊胚移植時可優先選擇D5上午形成的囊胚。但是鑒于本研究樣本數量有限，關于囊胚形成時間和囊胚質量對妊娠結局的影響，還需要更大樣本量、前瞻性研究驗證。