慢加急性肝衰竭預后標志物的研究現狀

李 健，杜亞秋，李德釗，季慧范，張成港，劉慶夏，郭曉林

吉林大學第一醫院 肝膽胰內科，長春 130021

慢加急性肝衰竭(ACLF)是指在慢性肝病基礎上出現的急性肝功能失代償，常伴隨肝臟和肝外器官衰竭，是常見的重癥肝病類型之一。目前，有關的臨床報道表明ACLF患者28 d無移植病死率高達50%～90%，預后差[1-3]。病毒性肝病、酒精性肝病或兩者共同作用是ACLF的主要病因[4]，因地區差異，病因分布并不完全相同。ACLF的發病機制尚未完全闡明，目前認為全身性炎癥反應和細胞因子風暴在ACLF和隨后的器官衰竭中起著中心作用[5]。對酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)-ACLF，系統性炎癥反應是核心機制，而在HBV-ACLF中，HBV激活引起的免疫-代謝失衡發揮了核心作用[6]。

在ACLF中，過度的免疫反應使肝細胞大量壞死，并逐漸擴散至全身，致肝外臟器受累，這種過度和不可控的炎癥反應進一步惡化肝損傷[7]，使得ACLF患者短期病死率高。因此，早期、準確的判斷患者病情及預后對于提高ACLF患者的生存率及優化資源配置具有重要意義。隨著定量蛋白組學技術的進步，肝病候選生物學標志物，尤其是非侵入性血清標志物亦得到發展[8]。近年來新發現的生物學標志物如炎癥相關性、代謝相關性、免疫反應相關性等逐漸進入研究者視野，本文就上述不同類型生物學標志物在ACLF預后中的研究現狀進行綜述，以期為ACLF預后評估提供參考。

1 炎癥相關的標志物

1.1 白細胞介素(IL)

1.1.1 IL-23及其受體(IL-23R) 在所有T淋巴細胞亞群中，輔助性T淋巴細胞(Th)17作為CD4+效應T淋巴細胞，被認為是參與多種急慢性肝病發病機制的主要效應細胞[9]，目前研究已經證明ACLF患者的外周血和肝臟實質中Th17增多，同時IL-23R在ACLF患者的Th17上呈現高表達。HBV感染通過抗原呈遞細胞，誘導單核細胞來源的樹突狀細胞產生大量的IL-23，一方面與Th17上的IL-23R結合，激活轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription-3, STAT3)通路，促使Th17功能激活和成熟[10-12]，另一方面通過IL-23/IL-17軸介導肝損傷[13]。激活的Th17產生大量的細胞因子，導致致病微環境，從而促進炎癥加重和疾病進展。故在ACLF患者中，異常增高的IL-23/IL-23R介導的信號轉導可誘導、加重炎癥，與肝病炎癥程度密切相關[14]，可以作為預后判斷的潛在標志物。

1.1.2 白細胞介素-22(IL-22) IL-22由免疫細胞產生，但主要靶向上皮細胞，最初IL-22被鑒定為一種肝保護性細胞因子，隨后被證明可保護多個器官免受損傷。此外，IL-22還通過刺激上皮細胞產生大量抗菌蛋白來防止細菌感染。肝臟再生的過程由多種細胞因子和生長因子激活的多條信號通路共同調控[15]。在這些通路中，信號轉導子和STAT3主要由IL-6和IL-22激活，是促進肝臟再生的有效途徑；以IFNγ為主的信號轉導因子STAT1是阻斷肝臟再生的的有效途徑。故STAT1和STAT3激活的平衡在控制肝損傷和肝臟再生中起著關鍵作用。綜上，IL-22對重癥肝病的預后有一定提示作用。

1.1.3 白細胞介素-6(IL-6) 全身炎癥反應是ACLF的標志[1,16]。IL-6在單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、成纖維細胞和內皮細胞中產生，并啟動急性期蛋白的產生，同時升高的IL-6被認為是一種明顯的促炎細胞因子，能迅速激活宿主防御系統，發揮多種功能[17]。在靶細胞上，IL-6與IL-6受體(IL-6R)結合，IL-6/IL-6R復合物與第二受體蛋白糖蛋白(gp)130結合，啟動信號傳導，信號通路持續激活可能導致肝損傷。已有研究[18]表明，IL-6的動態變化與疾病相關病死率有關，IL-6動態升高或持續高水平的患者病死率較高，故IL-6水平及持續時間同時對疾病的預后有提示作用。

1.2 B、T淋巴細胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator, BTLA) BTLA是CD28超家族的成員，與細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxie T lylnphoeyte assoeiated antigen-4, CTLA-4)、程序性壞死因子1(programmed death-1,PD-1)共同構成了一組抑制性受體。已有研究[19]表明，BTLA負性調節病毒特異性T淋巴細胞的功能、維持T淋巴細胞免疫耐受。ACLF的特點是易感染和T淋巴細胞免疫障礙。一項在健康人群、慢性乙型肝炎、HBV-ACLF患者中開展的研究[20]發現，HBV-ACLF患者外周血CD4+T淋巴細胞的BTLA表達明顯增加，而交聯BTLA可進一步抑制CD4+T淋巴細胞的活化、增殖及細胞因子的產生，促進CD4+T淋巴細胞的凋亡，使機體喪失清除病原體的能力，最終導致感染加重，從而影響ACLF的預后。

1.3 程序性死亡因子1(PD-1) PD-1是一種廣泛表達于多種類型免疫細胞的細胞表面蛋白[21]，如CD8+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞，且作為一種抑制性調控因子，與程序性死亡因子配體(programmed death ligand, PD-L)結合后，可以抑制T淋巴細胞增殖、IL-2及IFNγ等細胞因子產生，屬于負向調節T淋巴細胞作用的刺激信號[22]。研究表明，PD-1的上調可能有效地減輕CD8+T淋巴細胞的致病性反應和肝損傷[5,23]，即隨著ACLF病情加重，外周血CD8+T淋巴細胞上PD-1表達增高，與疾病嚴重程度呈正相關，故PD-1/PD-L的監測在ACLF疾病發展和轉歸中具有重要意義[24]。

1.4 損傷相關的分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs) DAMPs是細胞損傷或激活后釋放的多種具有免疫調節活性的細胞內分子，可通過模式識別受體誘導自身免疫[25]。主要包括高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1, HMGB1)、細胞核來源的組蛋白、熱休克蛋白、尿酸、線粒體轉錄因子等。其中HMGB1是一種很強的炎性因子，在炎癥過程中，HMGB1由壞死或凋亡細胞釋放，與其受體結合，誘導氧化應激和炎癥因子釋放，包括TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、MIPs等，導致持續的、放大的全身炎癥反應，并發生級聯反應，進一步加重肝損傷[26]。HMGB1水平越高，ACLF預后越差，故可作為ACLF的一種預后標志物。

2 代謝相關的標志物

2.1 脂多糖(lipopolysaccharides, LPS) LPS是由脂質和多糖組成的內毒素成分，是一種重要的炎癥誘導因子，可通過與炎癥相關細胞膜表面的Toll樣受體4(TLR4)結合進入細胞內并激活下游信號通路，合成促炎因子，推動炎癥反應的進行。細菌易位、LPS和DAMPs已經被證實是肝衰竭發病中的重要因素[20]，肝臟Kupffer細胞在LPS的作用下，分泌功能亢進，生成和釋放大量氧自由基和細胞因子等，加重肝損傷，同時研究還表明LPS可引起Kupffer細胞微結構改變及自噬[27]。因此，對于有高內毒素風險的患者來說，監測LPS水平顯得較為重要，LPS水平更高可能預示患者預后不佳，而及時有效的控制內毒素會使得患者獲得更大的臨床效益。

2.2 1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate , S1P) S1P是內皮完整性的關鍵因子，可以調節肝臟再生、血管張力控制和免疫應答等過程[28]。在ACLF中，維護血管屏障的完整性是一個重要的過程，可防止某些并發癥的出現，如出血、組織水腫、液體失衡、炎癥風暴等[29]。有研究[30]表明慢性重癥肝病患者血清S1P水平隨肝病進展而進行性下降，可作為早期死亡的預測指標。

2.3 M30/M65 M30/M65是一種反應肝細胞壞死及凋亡的標志物。角蛋白18(cytokeratin18, CK18)是構成肝細胞骨架的主要中間絲蛋白之一，參與肝細胞骨架的構成，對肝細胞周期及凋亡起一定的調控作用。CK18在肝細胞凋亡過程中，被切割成M30抗原片段，故通過血清M30能夠反映肝細胞凋亡水平。在壞死過程中，完整的CK18和角蛋白復合體被釋放出來，M65能夠對其及切割過的CK18片斷進行識別，故在此過程中，M65水平隨著壞死過程的進行而升高。目前已被用作急慢性肝病診斷和預后的生物標志物，包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和急性肝衰竭(ALF)。且已有研究[31]表明，在ACLF患者中M30和M65水平均明顯升高，且是3個月短期病死率的獨立預測因子。

2.4 甲胎蛋白(AFP) 目前的臨床研究很少有通過肝臟再生角度來評價ACLF的預后。AFP是一種體內豐富的血漿蛋白，是一種肝細胞再生的標志物。成人血清AFP高表達通常表明慢性肝炎或肝硬化患者發生肝細胞癌的可能性增高[32]。有研究表明[33]，在除外肝癌、胃癌等惡性腫瘤，AFP水平越高，HBV-ACLF預后越好，log10AFP≥2提示ACLF患者短期生存時間越長，這表明log10AFP是預測ACLF預后的有用指標。AFP可能是預測ACLF患者病死率的另一個重要指標。

2.5 纖溶酶原 纖溶酶原是一種蛋白酶原，主要合成于肝臟，存在于血漿，在激活物作用下變成有活性的纖溶酶，且在肝功能嚴重受損時會顯著降低。有研究[7]發現，入院時低水平的纖溶酶原與ACLF患者的病死率顯著相關，且在住院期間，纖溶酶原水平在生存組中逐漸升高，死亡組中逐漸下降。這種變化反映了ACLF患者病情改善、惡化和波動的過程。可能機制是：在ACLF患者中，纖溶酶原活化系統中的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和纖溶酶可活化肝細胞生長因子，參與肝損傷后基質重塑、調節肝損傷后肝細胞再生，故低水平的纖溶酶原可以阻礙肝細胞再生[34-35]，由此出現肝損傷、纖溶酶原消耗、肝細胞再生受損的惡性循環。故纖溶酶原可能是HBV-ACLF的一種潛在的預后生物標志物。

3 免疫相關的標志物

3.1 補體3(complement factor 3, C3) 補體是廣泛存在于血清、組織液和細胞膜表面的一組經活化后具有酶活性的蛋白質，其中C3水平在補體系統中最高。肝臟是生成免疫因子的重要器官，隨著肝功能的惡化，肝臟合成補體的能力逐漸降低。在NAFLD中，補體系統的廣泛激活與疾病嚴重程度的關系已經得到證實[36]，現多研究其在慢性乙型肝炎、ACLF中的作用。在ACLF患者中，研究發現生存組的C3和C3a的水平明顯高于死亡組，同時C3和C3a水平與MELD和CLIF-C Ofs評分呈負相關，這提示補體C3和C3a可能是ACLF的獨立預測因子[37]。

3.2 可溶性CD163(sCD163)和可溶性甘露糖受體(soluble mannose receptor, sMR) 肝臟Kupffer細胞占機體巨噬細胞總數的80%以上，在病毒性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎的肝臟炎癥和纖維化中起著關鍵作用[38]。CD163作為血紅蛋白結合珠蛋白清除劑受體，僅位于巨噬細胞和某種單核細胞上，并在脫落后，作為sCD163釋放到循環中。sMR在人血清中被發現，是一種主要在巨噬細胞和樹突狀細胞上發現的甘露糖受體的脫落產物，盡管對于該標志物研究較少，但在肝病、感染患者的血清中，sMR水平高于健康人群[39-40]。當被細菌和其他促炎細胞因子刺激時，預激活的Kupffer細胞會引發劇烈的炎癥反應，使得血清sCD163和sMR水平升高，從而促進ACLF的進展。研究[41]表明，炎癥標志物sCD163、sMR與MELD評分、CLIF-C ACLF可作為ACLF患者28、90和180 d病死率的預測因子。這提示肝Kupffer細胞在ACLF發生和發展中的重要性，因此，將巨噬細胞生物標志物，如sCD163、sMR等納入預后評分(如CLIF-C ACLF和CLIF-C AD)中，可能預測能力更佳。

3.3 中性粒細胞明膠酶相關脂質沉積蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL) NGAL是脂質運載蛋白2(lipocalin-2, LCN2)的基因表達產物，廣泛表達于各種組織和細胞，尤其是中性粒細胞[42]，作為一種急性期蛋白，可以調節各種免疫反應。當腎小管損傷時，腎臟合成NGAL增加，故尿NGAL水平升高，可作為腎功能不全的預測因子。最近研究[42]發現，在ACLF患者中，LCN2在肝臟總體表達顯著上調，并與INR和膽紅素相關，這提示肝細胞損傷可能導致NGAL升高。此外，中性粒細胞是表達LCN2的主要細胞類型，參與抗炎過程，也可以導致血漿NAGL增加。由此，ACLF血漿NGAL升高可能歸因于嚴重的肝細胞損傷與中性粒細胞活化[43-44]，進而引發后續的器官功能障礙，影響疾病預后。一項研究[42]結果顯示，肝硬化患者的NGAL水平顯著增加并與ACLF患者的預后呈現相關性。另外，CANONIC研究數據[45]亦顯示NGAL是ACLF病死率的重要預測因子。

4 核酸類標志物

miRNA是一種內源性的非編碼微小RNA，其功能是抑制特定的靶信使RNA(messenger RNA, mRNA)，從而調節特定的細胞蛋白質和細胞表型。miRNA通過控制mRNA的穩定性或翻譯過程來調節表達，從而影響細胞的分化、發育和凋亡[46]。越來越多證據[47]表明，某些miRNA可能與肝衰竭預后有關。其中miRNA-122是一種肝臟特異性miRNA，約占成人肝臟總miRNA數量的70%。miRNA-122在嚴重的ACLF和凝血疾病患者中明顯上調[48]。另有研究[49]發現miR-146a-5p、miR-122-3p和miR-328-3p等是ACLF短期死亡的獨立預測因子。這為進一步研究miRNA在ACLF發病機制及預后中的作用奠定基礎。

5 氧化應激標志物

氧化應激反應可以觸發體內細胞凋亡，是各種疾病發展過程中的關鍵步驟。晚期氧化蛋白產物(advanced oxidation protein products, AOPP)是體內氧化應激過程中生成的一類含雙酪氨酸的蛋白質交聯物。在氧化應激狀態下，氧化還原反應失衡導致蛋白質的氧化速率急劇增加，導致體內AOPP水平明顯升高，同時AOPP主要經肝臟清除，在肝功能衰竭時，AOPP清除率降低，導致AOPP產生與清除失衡，加重氧化應激過程。同時研究還發現AOPP能夠誘導單核細胞分泌TNFα等炎癥因子，加重肝細胞的凋亡。血清AOPP反映HBV-ACLF患者的氧化應激、炎癥狀態[26]，故可作為預測HBV-ACLF患者預后的重要潛在標志物。

6 小結與展望

目前ACLF 缺乏除肝移植以外的有效治療措施，具有高臨床病死率。因此，盡早探尋ACLF早期診斷、預警、預測的分子標志物至關重要。血清生物學標志物具有非侵入性、易于檢測、可反映肝損傷程度等特征，有廣闊的臨床應用前景。盡管本文總結了多種預后相關指標，但可用于臨床實際的標志物仍缺乏可靠依據和標準參考值，需要更多的實驗數據和大量的臨床病例來驗證。期待靈敏度更高、特異性更好、便于臨床檢測的預后標志物出現，以提升ACLF患者的多臟器衰竭的防治水平，有效改善ACLF的轉歸。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李健、郭曉林負責擬定寫作思路；李健、杜亞秋、李德釗、張成港、劉慶夏負責檢索文獻，分析資料；季慧范、郭曉林負責修改文章并最終定稿。