大菱鲆弧菌的分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)分析

郭欣碩

（遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 沈陽110032）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）被稱為“多寶魚”，由中國黃海水產(chǎn)研究所于20世紀(jì)90年代從英國引進(jìn)。遼寧省葫蘆島市的大菱鲆產(chǎn)業(yè)興起于2001年，大菱鲆引進(jìn)葫蘆島后，經(jīng)過近20年的發(fā)展，已成為葫蘆島市的支柱產(chǎn)業(yè)之一。惠及很多養(yǎng)殖戶，但多年來因未引進(jìn)原種魚苗，缺乏適當(dāng)?shù)慕】捣敝臣夹g(shù)，致使苗種優(yōu)勢遺傳性逐漸退化，疾病發(fā)生率逐年增加。養(yǎng)殖戶在使用藥物時(shí)，在病因不明的情況下，大量用藥，不僅導(dǎo)致病原菌的耐藥性，還產(chǎn)生大量的藥劑藥渣，疾病問題已成為制約大菱鲆產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸，因此開展大菱鲆耐藥性的相關(guān)研究勢在必行。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試藥物為我國目前被用于水產(chǎn)的抗菌藥物，包括氟苯尼考、恩諾沙星、甲砜霉素、硫酸新霉素、氟甲喹、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲 唑/甲氧芐啶。藥敏試劑板由全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站提供，病魚來自葫蘆島市興城市2個(gè)定點(diǎn)養(yǎng)殖場，1齡大菱鲆，30尾；細(xì)菌DNA提取試劑盒（Magen）。

1.2 病原菌的分離鑒定

對典型病癥個(gè)體樣品進(jìn)行解剖，在TCBS培養(yǎng)基中接種，28℃培養(yǎng)24h，觀察菌落特征，挑出可疑菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，28℃±1℃培養(yǎng)18～24h，經(jīng)多次純化，觀察菌落特征，初步分離出水生動物源弧菌。用細(xì)菌核酸提取試劑盒提取病原DNA，擴(kuò)增16 sRNA基因，經(jīng)測序后，通過NCBI比對序列查找相似菌株。

1.3 耐藥性分析

依據(jù)南京菲恩醫(yī)療科技有限公司提供的試劑板說明書，進(jìn)行藥敏分析試驗(yàn)，篩選純化后單個(gè)菌落，制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙骸ＴO(shè)置陽性、陰性對照，取200μL菌懸液于無菌生理鹽水中，混勻后制備成上樣菌懸液，將含有樣品菌懸液的藥敏分析試劑板放入恒溫培養(yǎng)箱中，28±1℃培養(yǎng)24～28h。觀察分析版各孔中細(xì)菌的生長情況，分析試劑板孔底變渾濁為陽性，孔底澄清為陰性。結(jié)果判定參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）公布的耐藥性標(biāo)準(zhǔn)以及南京菲恩醫(yī)療科技有限公司提供的方法判定。

2 結(jié)果

2.1 分離鑒定結(jié)果

經(jīng)過分離得到45株弧菌，其中大菱鲆弧菌23株。利用16sRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，基因片段約1500bp（圖1），將產(chǎn)物序列在NCBI的GenBank上進(jìn)行Blast分析比對，鑒定得到的菌株與大菱鲆弧菌（Vibrio Scophthalmi）同源性均在98%以上，結(jié)合形態(tài)初步鑒定為大菱鲆弧菌。

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 大菱鲆弧菌對藥物的敏感性 表1、表2結(jié)果表明，8種抗菌藥物對大菱鲆弧菌的總體敏感性不同，恩諾沙星MIC范圍在0.1～0.78μg/mL，呈高度敏感性，敏感率為100%；硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素MIC范圍是0.1～12.5μg/mL，敏感率分別為43.5%和87%；氟苯尼考MIC介于0.78～100μg/mL，敏感率為78.3%；磺胺甲 唑/甲氧芐啶MIC在1/0.2～12/10 2μg/mL上，敏感率為91.3%；磺胺間甲氧嘧啶鈉的MIC范圍是2～32μg/mL，敏感率77.9%；甲砜霉素和氟甲喹MIC均在1.56～200μg/mL，MIC濃度相對較高，耐藥率分別為52.2%和87.0%，說明明弧菌對兩種類型的藥物敏感程度較低。

表1 8種抗菌藥對大菱弧菌的敏感性

表2 抗菌藥物對大菱鲆弧菌的MIC值區(qū)間及敏感率對比結(jié)果

將分離得到的23株大菱鲆弧菌按照菌株種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到MIC50和MIC90，結(jié)果見圖2，甲砜霉素和MIC50和MIC90分別為9.089和75.34，氟甲喹的MIC50和MIC90分別為4.922和24.182，另外，甲砜霉素和氟甲喹的MIC50和MIC90均高于的它們的平均值，兩者顯示出較高的耐藥水平。

圖2 大菱鲆弧菌對各種抗菌藥物的感受性

3 討 論

本試驗(yàn)對遼寧省葫蘆島市的兩家大菱鲆養(yǎng)殖企業(yè)進(jìn)行調(diào)查，分離并鑒定出大菱鲆弧菌23株，大菱鲆弧菌在當(dāng)?shù)卮罅怫殷w內(nèi)普遍存在，且隨著月份和季節(jié)的變化，在水溫較高、病害多發(fā)的6～8月采集數(shù)量較高。春秋兩季分離出的弧菌較夏季多，也是大菱鲆腸炎的高發(fā)季節(jié)，其中弧菌是最主要的病原，大菱鲆弧菌、溶藻弧菌、遲鈍愛德華菌、鰻弧菌、鯊魚弧菌等都可引起大菱鲆腹水病。藥物敏感試驗(yàn)表明，大菱鲆弧菌對恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素藥物敏感性較高，甲砜霉素和氟甲喹的敏感性較低的MIC50高于平均水平，兩者耐藥性最強(qiáng)，在該地區(qū)可以將恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星用作治療和預(yù)防弧菌感染的首選藥物。而磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲 唑/甲氧芐啶、氟苯尼考、硫酸新霉素有部分敏感的藥物，在一定程度上也能抑制住菌株的生長。結(jié)果顯示，在大多數(shù)情況下，其對甲砜霉素和氟甲喹的耐藥性都很強(qiáng)，表明當(dāng)?shù)鼗【昕赡芤褜@些藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，在今后用藥過程中應(yīng)交替使用，避免長期過量使用引起耐藥性并造成經(jīng)濟(jì)損失。另外，可嘗試尋找安全高效的天然藥物來代替?zhèn)鹘y(tǒng)藥物等，以實(shí)現(xiàn)減量增效、提升養(yǎng)殖水產(chǎn)品質(zhì)量和安全性。