微量大鼠血漿中對乙酰氨基酚的LC/M S/M S定量檢測方法的建立

張 亮，廖宏俊，丁文杰，王小雪，郁 杰

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300）

非那西丁的體內代謝產物對乙酰氨基酚，又名泰諾林、必理通、百服寧。對于治療普通感冒引起的發熱以及緩解頭疼，關節疼等有良好的效果。作為分析化學的一個分支，生物分析廣泛的應用于外源性物質（化學合成或天然提取的候選藥物，基因改造的生物分子及它們的代謝產物或轉化后再修飾的產物）和生物系統中生物大分子（蛋白質、DNA、大分子藥物和代謝產物）等的定量測定。

LC/MS技術是以質譜為檢測手段的色譜技術，它既有液相色譜的高分離能力也有質譜的高靈敏度和高專屬性。在藥物微量雜質、藥物降解產物、及其生物轉化產物的分析鑒定、藥代動力學等研究領域得到廣泛的應用。本文采用LC/MS/MS建立了微量大鼠血漿中對乙酰氨基酚的定量檢測方法，并進行了方法學的驗證。

1 材料和方法

1.1 儀器設備及軟件系統儀器：AB SCIEX公司的Triple Quad 6500plus；Shimadzu LC-30AD超高效液相色譜儀和SIL-30ACMP自動進樣器；大龍MX-S渦旋混合儀；Eppendorf 5810R低溫高速離心機。數據處理系統：Analyst 1.6.3。

1.2 試劑和動物大鼠血漿購于BioreclamationINT，批號RAT353600；Acetaminophen-d4購自于Toronto Research Che micals Inc，批號：A161222；4-Acetamidophenol購自于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司，批號：5IXZK；甲醇購于SIGMA（色譜純）；乙腈購于SIGMA（色譜純）；還有去離子水，及其它分析純試劑。

4-Acetamidophenol儲備液：室溫黃光條件下精密稱取4-Acetamidophenol 2.531mg，放入玻璃瓶中，后加入2.531mL DMSO溶解，然后用50%ACN稀釋儲備液，得到濃度為1000ng/mL，2000ng/mL，10000ng/mL，50000ng/mL，200000ng/mL，400000ng/mL，800000ng/mL，1000000ng/mL的 標 準 曲 線工作液，以及質控樣品工作液LLOQ QC，LQC，GMQC，MQC，HQC，濃度分別為（1000ng/mL，3000ng/mL，20000ng/mL，500000ng/mL，750000ng/mL），于-30℃到-10℃條件下儲存。

Acetaminophen-d4儲備液：室溫黃光條件下精密稱取Acetaminophen-d4 2.135 mg，放入玻璃瓶中，然后加入2.135mL DMSO溶解即為所需工作液，然后用50%ACN稀釋得到1000 ng/mL的內標工作液，并于-30℃到-10℃條件下儲存。

1.3 液相色譜與質譜參數

（1）色譜條件：色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm；流動相：流動相B：0.1%FA and 2mM NH4OAc in H2O；流動相A：0.1%FA and 2mM NH4OAc in ACN/H2O（95:5；v:v）；洗液：R3:0.1%FA in ACN/MeOH/IPA/H2O(1:1:1:1，v:v:v:v)；R0，R1：50% MeOH；流 速：0.400 mL/min，柱溫：40℃；進樣量：15μL。

（2）質譜條件：溶劑揮發溫度600℃，電噴霧離子源（ESI）正離子模式，離子源噴射電壓為5000V，掃描方式為多反應監測（MRM），分析物4-Acetamidophenol離子對為152.2/110.2，內標Acetamidophenol-d4離子對為156.2/114.2。

1.4 樣品前處理在室溫條件下融解樣品，并逐個渦旋。取10.0μL標曲樣品、質控樣品或測試樣品，對于雙空白樣品和單空白樣品取10.0μL空白基質加入到新96深孔板中。在雙空白樣品孔中加入30.0μL 50% ACN，對其它孔內，分別加入30.0μL內標工作溶液（1000ng/mL），混合均勻。

向每個樣品孔內添加260μL 0.1%的甲酸乙腈溶液，封96孔板，渦旋約10min，然后于4℃，3200×g條件下離心10min。取30.0μL上清至另一新96孔板中，每個樣品孔中添加570μL去離子水，渦旋至少5min。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的獲得及方法的專屬性測定用移液器吸取190μL空白大鼠血漿至離心管中，然后分別加入10.0μL標曲和質控樣品工作液，渦旋混勻，即得到濃度為50.0ng/mL，100ng/mL，500ng/mL，2500ng/mL，10000ng/mL，20000ngmL，40000ng/mL，50000ng/mL標曲和質控樣品。

在分析批的開始加入雙空白樣品和單空白樣品，然后加入標準曲線樣品，并在分析批的最后再加入一條標準曲線。通過液相質譜得到相關數據，用Analyst軟件進行擬合，得到如圖1所示的標準曲線圖。如圖2、圖3、圖4分別是雙空白樣品圖譜、單空白樣品圖譜及定量下限樣品譜圖，從所得圖譜的結果可以得出對乙酰氨基酚及內標的峰形良好，對乙酰氨基酚及內標的分析不受基質中內源性物質的干擾。對乙酰氨基酚的出峰時間為0.95min，內標出峰時間為0.93min。

圖1 4-Acetamidophenol標準曲線圖

圖2 4-Acetamidophenol雙空白樣品圖譜

圖3 4-Acetamidophenol單空白樣品圖譜

圖4 4-Acetamidophenol定量下限樣品譜圖

2.2 準確度和精密度 準確度和精密度主要根據LLOQ、LQC、GMQC、MQC、HQC濃度水平的質控樣品來進行評估。依據法規要求，各濃度水平QC樣品平均值的偏差百分比（DEV%）不得超過±15%（LLOQ不得超過±20%），變異系數（CV%）不得超過15.0%（LLOQ不得超過±20%）。

從表1試驗結果來看10μL樣品處理量方法下，超過2/3的質控樣品滿足接受標準，且每個濃度都有超過50%的樣品滿足接受標準。因此，該方法的分析結果滿足法規要求。

表1 分析物4-Acetamidophenol質控樣品的DEV%與CV%

2.3 基質效應試驗考察了該處理方法下，低濃度和高濃度水平下基質對化合物和內標的影響。基質效應因子（MF），是用每個批次的空白基質提取后加上中間溶液得到的樣品中分析物和內標的峰面積，除以相應濃度的純溶液樣品中分析物和內標峰面積，計算得出。內標歸一化的MF由分析物的MF除以內標的MF得到。從表2、3、4的結果可以看出，該方法下內標歸一化的MF的變異系數均在8.2%以內，滿足接受標準（內標歸一化變異系數不大于15%）。該方法下化合物及內標沒有明顯的基質效應影響。

表2 分析物4-Acetamidophenol的基質效應

2.4 回收率從表5和表6的結果可知低濃度和高濃度水平的質控樣品中，分析物在每個濃度水平以及所有低高濃度水平的提取回收率的變異系數均在8.0%以下，內標的提取回收率的變異系數均在12.1%以內，滿足變異系數在15%以內的要求。因此該處理方法下，化合物和內標的回收率均滿足GLP法規下的要求。

表3 內標Acetamidophenol-d4的基質效應

表4 內標Acetamidophenol-d4歸一化基質效應

表5 分析物4-Acetamidophenol回收率

2.5 稀釋效應另外試驗測試了DQC樣品在20倍稀釋下的稀釋效應，10μL的樣品處理方法中三個重復樣品之間的變異系數為4.0，所有稀釋樣品的濃度與理論濃度之間的偏差均在±4.8%以內，滿足接受標準，因此該方法在稀釋效應方面滿足GLP法規要求（見表7）。

表7 分析物4-Acetamidophenol 稀釋效應

2.6 討 論生物分析的樣品大多來源于各種動物的血漿、血清或全血，也包括糞便其它體液。因此，動物福利是生物分析需要考慮的一個因素。動物福利要求，在動物飼養和給藥采集樣品期間，要讓動物很好的適應所處的環境，并采取一些措施來滿足試驗動物基本的自然需求。從動物福利角度來考慮，血液采集時嚴格按照體重的比例來采集，而我們通常的試驗中會經常用到大鼠。一般樣品分析需要處理30μL的樣品，由于大鼠等小型動物采樣量有限，為了滿足多時間點采樣的要求，不得不需要更多的試驗動物，來進行交叉采樣，這就增加了動物個體之間的差異對PK數據的影響。而如果將30μL的樣品處理量降至10μL，一只動物就能滿足整個試驗設計中各時間點采樣的要求，不僅可以減少試驗動物的使用量，采血量，減少動物之間的差異對PK數據分析準確性的影響，還可以滿足動物福利的法規要求。

從試驗結果來看，不管是從待分析物還是內標來看，該方式下內標及待分析物之間的基質效應還是回收率均滿足GLP法規的要求。另外，稀釋效應也均滿足GLP法規要求。因此從整個試驗結果的對比發現，微量取樣的數據是可靠的，微量取樣也可以滿足各方面的要求。因此，微量大鼠血漿中定量檢測對乙酰氨基酚的LC/MS/MS方法成功構建，也是可行的。