苯并［a］芘在厚殼貽貝體內(nèi)的富集及代謝特征

李 磊，曾夢(mèng)妮，王翠華，馬麗艷，張 璇，黃冬梅，蔣 玫

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.寶船生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司，上海 201203）

苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，BaP）是多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）中高致癌物質(zhì)的典型代表。多環(huán)芳烴可通過降雨、地下河流等方式最終流入海洋［1］。我國多處海域受到PAHs污染，對(duì)青島沿岸、象山港、海南洋浦灣等區(qū)域的海水檢測(cè)顯示，水體中BaP濃度為0.12～2.35 ng·L-1［3-4］。水環(huán)境中的BaP主要以溶解態(tài)、吸附于懸浮物中、與沉積物結(jié)合等形式存在，因其具有較高親脂性、疏水性和低生物降解性，可通過攝食作用、鰓呼吸作用以及表皮接觸滲透等方式進(jìn)入水生生物體并累積［5］。BaP進(jìn)入生物體后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生解毒反應(yīng)，BaP經(jīng)組織細(xì)胞中的混合功能氧化酶激活轉(zhuǎn)化為3-羥基苯并［a］芘（3-hydroxybenzo（a）pyrene，3-OH BaP）等羥基化合物、醌類或環(huán)氧化物［6］。

海洋中雙殼貝類因?yàn)V食性攝食方式，易在體內(nèi)富集多環(huán)芳烴等環(huán)境污染物，常作為監(jiān)測(cè)海洋環(huán)境污染的良好指示生物［7-8］。有學(xué)者先后研究了水體中多環(huán)芳烴在貝類體內(nèi)的吸收速率常數(shù)和釋放速率常數(shù)［9］、累積和凈化動(dòng)力學(xué)參數(shù)［10］等富集動(dòng)力特征，針對(duì)消化盲囊、鰓、閉殼肌等不同組織在貝類體內(nèi)的蓄積規(guī)律進(jìn)行了分析［11-12］。厚殼貽貝（Mytilus coruscus）作為雙殼貝類，在中國各海域均有分布。因此，研究厚殼貽貝對(duì)PAHs的蓄積規(guī)律對(duì)評(píng)價(jià)我國沿海水體的PAHs污染狀況具有重要意義。

本研究通過對(duì)厚殼貽貝在不同濃度BaP溶液中的富集和釋放實(shí)驗(yàn)，獲得內(nèi)臟團(tuán)、外套膜和閉殼肌對(duì)BaP的富集及釋放規(guī)律，分析BaP代謝產(chǎn)物3-OH BaP在3個(gè)組織中的時(shí)間與劑量效應(yīng)關(guān)系，初步闡明了BaP在厚殼貽貝各組織的代謝規(guī)律，以期為BaP在貝類體內(nèi)的轉(zhuǎn)化機(jī)制研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用海水為海水晶配制的人工海水，鹽度為26，水溫控制在（23±2）℃。厚殼貽貝取自浙江省枸杞島養(yǎng)殖海域，平均殼長為（119.6±7.7）cm，殼寬為（55.0±3.0）cm，體質(zhì)量為（130.6±17.3）g。實(shí)驗(yàn)前將厚殼貽貝暫養(yǎng)7 d，期間連續(xù)曝氣，并投喂螺旋藻粉。選取健康個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)容器為20 L的玻璃缸體，實(shí)驗(yàn)用水為14 L。BaP標(biāo)準(zhǔn)品和3-OH BaP標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司。丙酮、甲醇和乙腈均為美國默克公司生產(chǎn)的色譜純。

1.2 BaP的富集和釋放

1.2.1 富集和釋放實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證0.01%（丙酮體積占實(shí)驗(yàn)水體總體積比率）丙酮作為BaP助溶劑的可行性，在實(shí)驗(yàn)開始前對(duì)添加BaP試驗(yàn)組和添加了0.01%丙酮處理的BaP試驗(yàn)組中貽貝組織的BaP含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。結(jié)果表明，二者無顯著性差異（P＞0.05），說明0.01%丙酮作為BaP的助溶劑是可行的。

實(shí)驗(yàn)分為富集和釋放兩個(gè)階段，分別進(jìn)行10 d和5 d。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)置0.2、1.0、3.0 μg·L-13個(gè)濃度組，以人工海水（其中加入的丙酮體積占實(shí)驗(yàn)水體總體積的0.01%）作為對(duì)照組，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器各放入16只厚殼貽貝。實(shí)驗(yàn)期間每天換水1次，換水率100%，每天定時(shí)投喂螺旋藻粉。分別于實(shí)驗(yàn)的1、3、6、10、12、15 d從每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器中各隨機(jī)抽取2只貝類，分離其內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌3種組織于-80℃保存，待測(cè)分析每種組織內(nèi)的BaP和3-OH BaP的殘留量。

1.2.2 組織樣品前處理

每種厚殼貽貝組織樣品分別稱取1 g于10 mL的勻漿器中，加入2 mL超純水制成組織勻漿液。取上述勻漿液100μL，加入200μL乙腈，渦旋混合10 min，10000 r·min-1離心10 min，取上清液供高效液相色譜分析。同時(shí)開展BaP和3-OH BaP的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以滿足檢測(cè)質(zhì)控要求，回收率為90%～110%。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：CenturySIL C18-BDS（150 mm×4.6 mm，5μm）；BaP流動(dòng)相：甲醇-水（90∶10），激發(fā)波長265 nm，發(fā)射波長450 nm；3-OH BaP流動(dòng)相∶甲醇-水（87∶13），激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長450 nm；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量15μL；柱溫25℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用乙腈分別稀釋BaP和3-OH BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、10.0 ng·mL-1的BaP標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，濃度為1.0、4.0、8.0、10.0、25.0、50.0 ng·mL-1的3-OH BaP標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，色譜條件測(cè)定同1.2.3。BaP在0.1～10.0 ng·mL-1范圍內(nèi)，線性回歸方程為y＝116.56x＋10.156，相關(guān)系數(shù)R＝0.9996；3-OH BaP在1～50 ng·mL-1范圍內(nèi)，線性回歸方程為y＝3.0172x＋3.2594，相關(guān)系數(shù)R＝0.9967。以信噪比S／N＝3求得BaP和3-OH BaP檢出限分別為0.1μg·kg-1和0.3μg·kg-1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，顯著性差異檢驗(yàn)采用單因素方差分析（ANOVA）和雙變量相關(guān)性檢測(cè)法，相關(guān)性分析采用Dunnet多重比較和皮爾遜（Pearson）方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種組織對(duì)BaP的富集與釋放規(guī)律

各試驗(yàn)組的厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)對(duì)BaP的富集和釋放情況如圖1所示。在富集階段，內(nèi)臟團(tuán)中BaP富集含量均隨時(shí)間的增加而增加，1.0和3.0 μg·L-1濃度組間無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于0.2μg·L-1濃度組和對(duì)照組（P＜0.05）。在清水釋放階段（11～15 d），3個(gè)濃度組內(nèi)臟團(tuán)BaP含量隨時(shí)間的延長逐漸下降。釋放前期階段（12 d），3個(gè)濃度組間無顯著性差異（P＞0.05）；釋放后期階段（15 d），高濃度組（3μg·L-1）內(nèi)臟團(tuán)中BaP含量變化顯著高于1.0μg·L-1和0.2μg·L-1低濃度組（P＜0.05）。

各試驗(yàn)組的厚殼貽貝外套膜對(duì)BaP的富集和釋放情況如圖2所示。外套膜中BaP富集含量在富集階段均隨時(shí)間的增加而增加；3個(gè)濃度組間有顯著性差異（P＜0.05），且與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。在清水釋放階段（11～15 d），3個(gè)濃度組外套膜BaP含量隨時(shí)間的延長逐漸下降。釋放前期階段（12 d），3個(gè)濃度組外套膜BaP含量有顯著性差異（P＜0.05）；釋放后期階段（15 d），2個(gè)高濃度組（1.0μg·L-1和3.0 μg·L-1）與低濃度組（0.2μg·L-1）差異顯著（P＜0.05）。

圖2 厚殼貽貝外套膜對(duì)BaP的富集和釋放情況Fig.2 Enrichment and release of BaP in outer membrane of M.coruscus

各試驗(yàn)組的厚殼貽貝閉殼肌對(duì)BaP的富集和釋放情況如圖3所示。在富集階段，閉殼肌中BaP富集含量均隨時(shí)間的增加而增加；1.0 μg·L-1和3.0μg·L-1濃度組間差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于0.2μg·L-1濃度組和對(duì)照組（P＜0.05）。在清水釋放階段（11～15 d），閉殼肌組織BaP含量隨時(shí)間的延長逐漸下降。釋放前期階段（12 d），2個(gè)高濃度組閉殼肌中BaP含量顯著高于0.2μg·L-1濃度組；釋放后期階段（15 d），3個(gè)濃度組間無顯著差異（P＞0.05）。

從圖1～圖3可知，厚殼貽貝各組織對(duì)BaP的富集含量高低表現(xiàn)為內(nèi)臟團(tuán)＞外套膜＞閉殼肌。

圖1 厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)對(duì)BaP的富集和釋放情況Fig.1 Enrichment and release of BaP in visceral mass of M.coruscus

圖3 厚殼貽貝閉殼肌對(duì)BaP的富集和釋放情況Fig.3 Enrichment and release of BaP in closed shell muscle of M.coruscus

厚殼貽貝3種組織對(duì)BaP的吸收速率與釋放速率如表1所示。從表1可知，富集階段（1～10 d）和清水釋放階段（11～15 d），厚殼貽貝3種組織對(duì)BaP的吸收速度和釋放速率基本都隨BaP暴露濃度增加而增加。從表1可見，各組織對(duì)BaP的吸收速率和釋放速率大小表現(xiàn)為內(nèi)臟團(tuán)＞外套膜＞閉殼肌。

表1 厚殼貽貝3個(gè)組織對(duì)BaP的吸收速率和釋放速率Tab.1 Enrichment and release rates of BaP in three tissues of M.coruscus

2.2 3種組織中代謝物3-OH BaP含量與BaP的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系

在BaP暴露下，厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中3-OH BaP含量隨暴露時(shí)間的變化如圖4～圖6所示。

圖4 厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)中3-OH BaP與BaP的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系Fig.4 Time effect relationship between 3-OH BaP and BaP in visceral mass of M.coruscus

圖6 厚殼貽貝閉殼肌中3-OH BaP與BaP的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系Fig.6 Time effect relationship between 3-OH BaP and BaP in closed shell muscle of M.coruscus

在富集階段，富集前期（1～6 d），厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)中3-OH BaP含量各濃度組間差異不顯著，富集后期（10 d）高濃度組3.0μg·L-1內(nèi)臟團(tuán)中3-OH BaP含量顯著高于0.2μg·L-1和1.0 μg·L-1濃度組（P＜0.05），除第1天外，厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)中3-OH BaP含量各濃度組與對(duì)照組均有顯著差異（P＜0.05）。厚殼貽貝外套膜中3-OH BaP含量在整個(gè)富集階段，均表現(xiàn)為3.0μg·L-1濃度組顯著高于0.2μg·L-1和1.0μg·L-1濃度組（P＜0.05），且與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）。第1天，厚殼貽貝閉殼肌中3-OH BaP含量濃度組間差異不顯著（P＜0.05），第3、6、10天，各濃度組差異顯著（P＜0.05）。

在清水釋放階段，厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中3-OH BaP含量均隨釋放時(shí)間的增加而減少，各組織中3-OH BaP含量仍隨BaP暴露濃度增加而增加。厚殼貽貝各組織中代謝物3-OH BaP含量的釋放率變化規(guī)律表現(xiàn)為內(nèi)臟團(tuán)（44.7%～52.0%）＞外套膜（41.5%～43.5%）＞閉殼肌（19.4%～28.1%）。

圖5 厚殼貽貝外套膜中3-OH BaP與BaP的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系Fig.5 Time effect relationship between 3-OH BaP and BaP in the outer membrane of M.coruscus

2.3 3種組織3-OH BaP含量與BaP累積量的劑量效應(yīng)關(guān)系

在不同BaP暴露濃度下，厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中BaP累積量與3-OH BaP含量變化的相關(guān)關(guān)系如表2所示。厚殼貽貝在暴露階段末期（10 d），內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中代謝物3-OH BaP含量隨著BaP實(shí)際累計(jì)量的增加而增加。各濃度組內(nèi)臟團(tuán)中BaP實(shí)際累積量與3-OH BaP含量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.920～0.944；外套膜中3-OH BaP含量與BaP累積量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.833～0.936；閉殼肌中3-OH BaP含量與BaP累積量的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.899～0.941，均表現(xiàn)為顯著的正相關(guān)。

表2 富集階段末期3個(gè)組織中3-OH BaP與BaP含量變化的相關(guān)關(guān)系Tab.2 Correlation between 3-OH BaP and BaP content in three tissues of M.coruscus exposed to BaP at the end of enrichment period

3 討論

3.1 BaP脅迫下的3種組織BaP累積量的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系

本研究結(jié)果表明，在富集階段，厚殼貽貝暴露在不同濃度BaP溶液中，其內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中BaP富集含量均表現(xiàn)為劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)的正相關(guān)關(guān)系。因?yàn)锽aP自身具有較高的辛醇-水分配系數(shù)（Kow）和較高的疏水性，丙酮助溶后可提高其生物利用性，增加了厚殼貽貝對(duì)BaP的富集作用［9］，在水溶液環(huán)境中易被生物體吸收。SKARPHéeINSDóTTIR等［13］研究了BaP對(duì)藍(lán)貽貝DNA加合物形成的影響，發(fā)現(xiàn)貽貝體內(nèi)BaP濃度隨著暴露時(shí)間的延長而增加，本研究結(jié)果與其一致。水生生物可以產(chǎn)生有效的解毒機(jī)制來消除污染物，但這種機(jī)制是需要時(shí)間來逐步釋放的，且并不能完全消除污染物［14］。在清水釋放階段結(jié)束時(shí)，從圖1～圖3可明顯看出，各組織中BaP仍有殘留。

3.2 BaP脅迫下3種組織BaP的累積量和3-OH BaP含量的變化特征

本研究顯示，3個(gè)組織對(duì)BaP的吸收速率大小為內(nèi)臟團(tuán)＞外套膜＞閉殼肌，這種組織差異性可能與不同組織的生化組成和生理特性有關(guān)。PAHs具有很強(qiáng)的親脂性，已有研究證明，組織內(nèi)的脂質(zhì)含量是生物對(duì)親脂性多環(huán)芳烴累積的重要和決定性因素［15］，而脂肪含量高的組織更容易富集多環(huán)芳烴［16］。外套膜和閉殼肌的脂肪含量為3.1%［17］，內(nèi)臟團(tuán)中的消化盲囊脂肪含量最高達(dá)16.1%［18］，導(dǎo)致了內(nèi)臟團(tuán)相對(duì)較高的BaP富集能力。

在清水釋放階段（11～15 d），3個(gè)組織中BaP含量在釋放階段前期迅速降低，3個(gè)組織對(duì)BaP釋放率大小表現(xiàn)為內(nèi)臟團(tuán)＞外套膜＞閉殼肌。生物體內(nèi)各組織對(duì)BaP的釋放主要受控于新陳代謝活動(dòng)、擴(kuò)散作用以及排泄作用［19］，內(nèi)臟團(tuán)中含有各種代謝酶，能夠?qū)aP轉(zhuǎn)化為代謝物或直接排出以降低其含量，從而維持機(jī)體較低的污染濃度［20］，外套膜中BaP的排出主要通過血細(xì)胞的滲出進(jìn)行，相對(duì)于內(nèi)臟團(tuán)多種酶的作用來說要弱得多［21］；而閉殼肌基本由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白組成，無代謝、消化等功能［22］。

3.3 BaP脅迫下代謝產(chǎn)物3-OH BaP作為生物標(biāo)志物

目前，3-OH BaP在環(huán)境監(jiān)測(cè)中常作為生物暴露于BaP的生物標(biāo)志物［23］。本研究顯示，厚殼貽貝3個(gè)組織中BaP實(shí)際累積量與3-OH BaP含量變化均呈明顯的正相關(guān)性。由于不同濃度的BaP在進(jìn)入生物體后，各組織呈現(xiàn)出一種防御解毒反應(yīng)，激活了細(xì)胞內(nèi)混合功能氧化酶，將BaP轉(zhuǎn)化為羥基代謝物，BaP濃度越高，生物的這種應(yīng)激反應(yīng)就越強(qiáng)烈［24］。在外界BaP持續(xù)不斷地脅迫下，生物機(jī)體通過混合功能氧化酶激活轉(zhuǎn)化為主要羥基化合物3-OH BaP產(chǎn)生解毒反應(yīng)［25］。因而厚殼貽貝內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、閉殼肌中3-OH BaP含量變化與BaP暴露時(shí)間呈顯著時(shí)間效應(yīng)關(guān)系（表2）。由此可見，厚殼貽貝暴露在BaP水溶液環(huán)境中，代謝產(chǎn)物3-OH BaP的含量變化可以較好地反映環(huán)境中BaP的污染水平，并表征厚殼貽貝被BaP污染后的應(yīng)激效應(yīng)，能夠作為BaP的環(huán)境監(jiān)測(cè)中貝類生物較靈敏的生物標(biāo)志物。