茅蒼術組培快繁技術研究

李亮杰 楚宗麗 李猛 孫曉偉 王鵬博

摘 要：茅蒼術是重要的道地藥材，但由于繁殖困難和采伐過度，導致野生資源瀕危，產量大幅度下降。為解決這一問題，利用植物組織培養的方法，以茅蒼術種子為外植體，對初代培養的建立及不定芽誘導、增殖和生根的適宜激素濃度進行了篩選，以期為茅蒼術的組培快繁生產提供技術支持。結果表明：初代培養以種子去皮、0.1%升汞消毒10min效果最佳;不定芽誘導以MS+6-BA 3.0mg/L誘導率最高，配合NAA濃度0.4mg/L和0.8mg/L的不定芽誘導率分別為96.77%、95.78%。其次是MS+6-BA 2.0mg/L，添加NAA濃度0.2mg/L和0.4mg/L的誘導率分別為94.53%、95.22%。增殖培養以MS培養基添加6-BA 3.0mg/L的增殖系數最高，為11.88;其次是2.0mg/L，增殖系數在9.5以上;但以MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.4mg/L增殖系數和長勢綜合效果最好。生根培養以培養基配方為1/2MS+NAA0.5mg/L生根效果最佳。

關鍵詞：茅蒼術;組織培養;不定芽;增殖;快繁

中圖分類號 Q949.783.5 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2021）21-0033-05

Absrtact： Atractylodes lancea is an important Chinese genuine medicine.However， due to the difficulty of reproduction and over exploitation， wild resources are endangered and the yield is greatly reduced in recent years.To solve this problem， the keys for the rapid propagation of tissue culture for Atractylodes lancea were studied here including the construction for primary culture， adventitious bud induction， proliferation and rooting culture using the mature seeds as material， provides a technical support for rapid propagation of Atractylodes lancea. The results showed that seeds without coat and mature seeds were disinfected with 0.1% HgCl for 10minutes had the best effection.For adventitious buds induction， MS+6-BA 3.0mg/L has the most induction rate， combined with the NAA concentration of 0.4mg/L and 0.8mg/L showed the induction rate of 96.77% and 95.78%， respectively.The second is Ms+6-BA 2.0mg/L， combined with the NAA concentration 0.2 and 0.4 showed the induction rate of 94.53% and 95.22%， respectively.For proliferation， MS+6-BA 3.0mg/L has the most propagation coefficient of 11.88，the second is 2.0mg/L， with the propagation coefficient more than 9.5.But with MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.4mg/L was the best for the comprehensive effect of proliferation coefficient and growth.1/2 MS+NAA0.5mg/L was the best medium for rooting.

Key words： Atractylodes lancea; Tissue culture; Adventitious bud; Proliferation; Rapid propagation

蒼術（Atractylodes）是菊科蒼術屬（Atractylodes）多年生植物，我國有朝鮮蒼術[Atractylodes.coreana （Nakai） Kitam.]、茅蒼術[Atractylodes lancea （Thunb） DC.]、北蒼術[Atractylodes chinensis （DC） Koidz.]、關蒼術（Atracylodes japonica Koidz.Ex Kitam.）及白術（Atractylodes macrocephala Koidz.）5類[1，2]。茅蒼術即為南蒼術，《中國植物志》將茅蒼術和北蒼術歸為蒼術一個種[2]。茅蒼術主產于江蘇、安徽、河南等地，為著名的道地藥材[3]。

茅蒼術根莖入藥，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等作用[4]，主要藥效組分為揮發油類物質[5-7]，南方氣候是茅蒼術產生優質組分的必要條件[8]。目前對蒼術需求逐年增加，而生長土地減少和人們對野生蒼術的采挖，導致茅蒼術產量銳減[9-12]。同時茅蒼術生長緩慢，花為雌雄同株或異株，不易受精，種子發芽率低[13]，依靠有性繁殖遠不能滿足對茅蒼術的需求，植物組織培養技術為茅蒼術的快速繁殖提供了有效途徑，同時能夠除去由于多年無性繁殖攜帶的病菌[14，15]。研究發現，組織培養途徑不影響藥材化學成分的積累[16，17]。

國內學者對茅蒼術的組織培養技術進行了探索，研究了影響茅蒼術組培快繁效率因素，如不同滅菌方式和處理時間對初代培養的影響[18-21]，增殖培養基和生根培養基對茅蒼術增殖和生根的影響[18-25];研究了不同初代培養材料的培養效果，常用的材料有蒼術種子[18-20]、根莖側芽[21]、帶腋芽莖段[22]等;研究了主要的增殖方式，主要通過愈傷誘導和不定芽增殖，愈傷誘導的外植體有葉片、葉柄[23-24]、根、胚軸[19，25]、子葉[19]等。

茅蒼術在河南信陽有野生分布，并有較大面積的仿野生種植。近年來，隨著市場對茅蒼術的需求量逐年增加，茅蒼術的種苗繁殖慢是急需解決的問題。近十幾年來，國內學者雖然針對茅蒼術組織培養已展開了一定的研究，但真正將組培快繁技術應用到茅蒼術的組培工廠化生產，仍有很多問題需要進一步研究。為此，本研究利用成熟種子為外植體，探究去種皮后的啟動培養、不定芽誘導和快繁及生根培養等生產程序中適宜的繁殖方式和適宜的培養基，研究不同世代組培苗對植物激素的反應，為茅蒼術種苗的工廠化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2019年和2020年的9—11月，于信陽大別山道地藥材示范園采集成熟種子。

1.2 培養基 培養基以MS或1/2MS（大量元素減半，其他不變）為基本培養基，添加不同濃度的激素組合（mg/L），添加蔗糖3%，瓊脂0.7%，pH值調為5.8，設置不同組合。培養基滅菌壓力0.1MPa，溫度121℃，滅菌時間25min。

1.2.1 初代培養基 2種配方，M1：MS基本培養基;M2：MS+6-BA1.0+NAA0.5+GA1.0（單位mg/L，下同）。

1.2.2 叢生芽誘導與增殖培養基; 6種濃度組合，配方如下：

Z1a：MS+6-BA1.0+NAA0.1， Z1b：MS+6-BA1.0+NAA0.2;

Z2a：MS+6-BA2.0+NAA0.2， Z2b：MS+6-BA2.0+NAA0.4;

Z3a：MS+6-BA3.0+NAA0.4， Z3b：MS+6-BA3.0+NAA0.8。

1.2.3 生根培養基 3個激素濃度，配方如下：

1/2MS+NAA0.2;1/2MS+NAA0.5;1/2MS+NAA1.5

1.3 培養方法

1.3.1 外植體處理 選健壯的種子加洗潔精清洗干凈，流水沖洗30min，無菌水浸泡3～6h，超凈工作臺上75%酒精浸泡30s，0.1%升汞消毒6～15min，無菌水沖洗3～5次。滅菌后種子分為剝去種皮（去皮并切去部分子葉，胚根接種）和保留種皮2種方式接種。

1.3.2 初代培養 消毒后的種子接種在初代培養基，每瓶接種2～3粒，針對不同種皮處理方式、不同滅菌時間，每處理接種20～30瓶，設置3個重復。置（23±1）℃條件下，5～10d統計污染情況，20d統計出苗情況。

1.3.3 誘導和增殖培養 將初代培養得到的無菌苗，切去根和葉片，胚軸保留葉腋生長點，轉接到誘導培養基中，每瓶接種3塊組織，每處理接種24瓶。35d統計出苗的組織塊數。將上述叢生芽分離，接種到6種不同激素濃度的增殖培養基中，每瓶接種3個芽，每處理接種15瓶，35d后統計增殖芽數。

1.3.4 生根培養 將增殖所得的不定芽，3～4個葉后接種到生根培養基，每瓶接種2～4苗，30d統計生根率。以上處理分別3個重復。

1.3.5 統計方法 相關計算公式如下：

污染率（%）=污染種子數/接種種子數×100;

發芽率（%）=發芽種子數/接種種子數×100;

誘導率（%）=誘導出不定芽的芽數/接種芽數×100;

增殖系數（%）=增殖后不定芽個數/接種芽數×100

利用Excel 2010和SPSS 26.0對數據進行分析，多重比較采用Duncan′s法。

2 結果與分析

2.1 初代培養的建立

2.1.1 培養基和種皮處理方式對種子萌發和生長的影響 接種后的種子培養20d統計出苗率，未剝種皮處理在M1、M22種培養基上出苗率為分別為34.68%、39.19%，剝皮處理后出苗率分別為64.75%、79.79%，相同培養基不同處理方式之間差異達極顯著，對于相同處理不同培養基之間，剝皮處理出苗率差異顯著，未剝皮處理差異不顯著（見表1）。

未剝種皮和剝皮幼苗長勢不同，剝皮的種子發芽后幼苗葉片淡綠，莖伸長，有1～2條初生根長成正常植株。未剝皮幼苗莖伸長發芽速率慢（圖1）。在初代培養中，兩類培養基幼苗長勢不同，不添加6-BA的培養基M1中，幼苗伸長（圖2A），添加有細胞分裂素6-BA的培養基M2中，根和伸長生長不明顯，初代苗有增殖現象（圖2B、C）。

2.1.2 滅菌時間對初代培養影響 5個滅菌時間，隨著消毒時間的延長污染率逐漸降低（表2），6min、8min、10min3個時間污染率差異顯著，10min以后，隨滅菌時間的延長污染率降低差異不顯著。隨著消毒時間的延長出苗率升高，6min、8min、10min3個時間出苗率差異顯著，但消毒10min以后隨著消毒時間延長成苗率范圍降低，綜合污染率和成苗率，表明10min消毒效果最好。

2.2 不同激素濃度對不定芽誘導的影響 胚軸誘導培養3d，葉腋處嫩葉長出;7d傷口變大，有顆粒狀凸起出現;15d外植體傷口可見愈傷組織，葉腋處出現叢生嫩芽;28d底部傷口長成堅硬、形狀不規則的愈傷組織，葉片展開，生成叢生芽（圖3 D、E、F）。不同激素濃度的培養基中，不定芽誘導率不同，在6-BA3.0、NAA0.4（mg/L）的Z3a號培養基中不定芽誘導率最高，為96.77%，其次是6-BA 3.0，NAA 0.8（mg/L）的Z3b號培養基，誘導率為95.78%，兩者差異不顯著，與含6-BA 1.0（mg/L）的Z1a、Z1b培養基誘導率差異顯著，與含6-BA 2.0的Z2a、Z2b號培養基差異不顯著（表3），表明含6-BA 3.0，NAA 0.4（mg/L）時培養基誘導能力最強。

2.3 不同激素濃度對不定芽增殖的影響 將誘導出不定芽切成單芽接種在增殖培養基中，統計增殖芽數并計算增殖系數，結果表明，培養基中6-BA為3.0（mg/L）時增殖系數最高，為11.88，為2.0（mg/L）時增殖系數在9.5以上，為1.0時增殖系數為5.0，差異顯著（表4）。不同激素濃度對苗的長勢有影響，6-BA為3.0mg/L時葉片不易伸長（圖3A、B），6-BA為2.0時，低濃度NAA（0.2mg/L）不定芽伸長不明顯（C：Z2a、F），NAA為0.4mg/L時，苗伸長，出現莖稈和節間（D：Z2b、G）。6-BA為1.0（mg/L）、NAA為0.1（mg/L）時葉片伸展（E、H）。表明適宜的細胞分裂素濃度需對應的生長素濃度才能利于苗的健壯生長。綜合增殖系數和苗長勢，培養基中6-BA為2.0、NAA為0.4（mg/L）時適合初代苗的增殖。同時發現，隨著增殖世代的增加，組培苗對細胞分裂素反應敏感，增殖能力強，苗嫩，呈黃綠色（圖4A），后面世代培養中，培養基不添加細胞分裂素可實現壯苗（圖4B）。

2.4 生長素濃度對不定芽生根的影響 由表5和圖5可知，3種生根培養基中，以NAA濃度0.5mg/L的生根率最高，為97.78%，生長速度最快，根長勢最好，3種培養基對生根率的影響差異不顯著，且生根率都在90%以上。表明3種培養基都可以進行生根培養，其中以配方1/2MS+NAA0.5mg/L效果最好。

3 討論與結論

3.1 初代培養的建立 外植體表面滅菌是建立無菌培養的第一步，不同外植體滅菌難易程度不同，根據外植體的來源和老嫩程度的不同，利用升汞進行表面滅菌的時間一般在5～10min，時間越長滅菌越徹底，但對外植體損傷越大。在茅蒼術的不同的外植體研究中，李西騰等利用根莖側芽、李鴻盛等利用在光照培養箱種植塊根獲得的帶腋芽莖段，利用次氯酸鈉和升汞溶液結的方式進行消毒處理[21，22]建立無菌培養。而蒼術種皮有絨毛，藥液不易進入，成熟種子由于生長時間長，滅菌困難，巢建國等[19]采用的0.1%升汞消毒種子15min。本試驗在成熟種子完成預處理后，去掉種皮后再消毒，0.1%升汞消毒10min達到理想的消毒效果。以種子為外植體的快繁中，種子萌發是快繁的基礎，路成[26]等研究美女櫻種子的組培表明，蒸餾水浸泡種子，并且切除兩端0.01cm處以破壞種皮才可誘導成苗，不破壞種皮不可生苗。本試驗對種子進行培養發現，將種皮剝去，損傷部分子葉有利于茅蒼術種子萌發。

3.2 植株再生 組織培養中主要通過器官發生和體細胞胚胎發生2種途徑獲得再生植株，器官發生途徑分為直接器官發生途徑（外植體不需要脫分化形成愈傷組織而直接成苗）和間接器官發生途徑（外植體經脫分化形成愈傷再分化形成苗）[27]，茅蒼術主要是通過器官發生途徑實現再生。巢建國等利用無菌苗分割成的胚根、胚軸、子葉和真葉多種材料直接誘導叢生芽，以胚軸誘導率最高[19]，宋剛等[25]在茅蒼術規模化組培快繁研究中利用胚軸直接增殖再生。劉海萍等[23]、宋剛等[24]利用無菌苗的葉片、葉柄在添加2，4-D的培養基，通過誘導愈傷組織實現間接再生。本研究利用胚軸直接實現不定芽再生，雖然試驗過程中也有愈傷組織產生，但未進行愈傷組織再分化，簡化了再生程序，便于在生產中應用。

3.3 增殖培養 在增殖培養中，細胞分裂素濃度是影響增殖系數的關鍵，生長素影響種苗的生長和質量，劉海萍等[23]研究發現，6-BA在2.0～3.0mg/L、IBA為0.4mg/L時，芽的增殖率較高，苗長勢好;當6-BA濃度大于3.0mg/L時，茅蒼術的生長受到抑制;李西騰等[21]研究發現，MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L葉片叢芽誘導最高，但在繼代的前期（2～3代）所用激素的濃度相對高些，6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L較好，隨著繼代代數的增加，要求激素的濃度降低，到8～10代時，6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L較好，認為可能是激素積累的原因。宋剛等[24]發現，6-BA10.mg/L+NAA0.15mg/L叢生芽增殖系數最高為15，但該報道未提供計算該增殖系數的基本苗數。本研究結果表明，6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L中增殖系數為7.4，雖不及6-BA 3.0mg/L高，但芽苗生長健壯，在后續繼代增殖培養中，增殖芽數較高，但苗弱小，認為該濃度不宜長期在增殖培養中使用，與李西騰等[21]研究結果叢生芽增殖前期需要高濃度激素，但長期使用會對叢芽誘導產生影響的結果一致。筆者認為，在工廠化生產中，可以降低細胞分裂素濃度，采用6-BA濃度為1.0～1.5mg/L范圍內進行快繁，以降低高濃度細胞分裂素對苗的影響，提高種苗質量。

關于生長素的濃度對苗生長的影響，劉海萍等[23]等研究發現，當IBA質量濃度小于0.4mg/L時，芽苗顏色淺，比較纖弱;當IBA質量濃度大于0.4mg/L時，芽的分化率低。本研究發現，當6-BA為2.0時，NAA為0.2mg/L不定芽伸長不明顯（C：Z2a），為0.4mg/L時苗伸長，出現莖稈（D：Z2b）。6-BA為1.0mg/L時，NAA濃度為0.1mg/L葉片伸展，株型正常，表明適宜的細胞分裂素濃度需對應的生長素濃度才能利于苗的健壯生長。而6-BA為3.0mg/L，NAA為1.0mg/L比為0.6mg/L增殖率低，可能與生長素具有兩重性、低濃度促進植物生長，過高濃度時抑制植物生長有關[28，29]。

本研究以剝皮種子為外植體進行培養有利于出苗和降低污染，初代培養增殖培養基以6-BA2.0+NAA0.4增殖效果理想。在后續增殖培養中，降低細胞分裂素濃度，有利于壯苗，生根培養基以配方為1/2MS+NAA0.5mg/L最適宜。

參考文獻

[1]傅立，陳潭，郎楷永，等.中國高等植物[M].青島：青島出版社，2001.

[2]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，2004，78（1）：024-029.

[3]鄧娟.茅蒼術的種質資源調查及質量評價[D].南京：南京中醫藥大學，2009.

[4]中華人民共和國藥典：2010年一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：150.

[5]郭蘭萍，劉俊英，吉力，等.茅蒼術道地藥材的揮發油組成特征分析[J].中國中藥雜志，2002，27（11）：814-819.

[6]WANG Y， DAI? CC， ZHAO，YW，et al.Fungal Endophyte-Induced Volatile Oil Accumulation in Atractylodes lancea Plantlets Is Mediated by Nitric Oxide，Salicylic Acid and Hydrogen Peroxide [J].Process Biochemistry，2011，46（3）：730-735.

[7]REN，CG，CHEN，Y.and DAU CC.Erratum to：Cross-Talk between Calcium-Calmodulin and Brassinolide for Fungal Endophyte-Induced Volatile Oil Accumulation of Atractylodes lancea Plantlets [J].Journal of Plant Growth Regulation，2014，33：903-903.

[8]郭蘭萍，黃璐琦，蔣有緒，等.影響蒼術揮發油組分的氣候主導因子及氣候適宜性區劃研究[J].中國中藥雜志，2007，32：888-893.

[9]任全進，于金平，盛寧，等.江蘇珍稀瀕危植物的調查與保護對策[J].中國野生植物資源，1997，16（4）：14-17.

[10]趙丹，周佳宇，戴傳超.藥用植物茅蒼術資源的開發利用現狀[J].植物學研究，2016，5（3）：74-82.

[11]丁立威.蒼術缺口大，行情節節高：蒼術市場走勢分析與后市預測[J].中國現代中藥，2006，8（2）：45-46.

[12]HE S A，HE H S，LU Y.The conservation and utilization of Atractylodes lancea（Thunb.） DC [J].Plant Res Environ，1993，2（1）：1.

[13]彭華勝，王德群.南蒼術與野生白術的開花動態研究[J].現代中藥研究與實踐，2007，21（3）：20-22.

[14]劉海萍，巢建國.蒼術類藥材生物學與質量研究進展[J].中醫藥學刊，2005，23（12）：2179-2180.

[15]鞏振輝，申書興.植物組織培養（第二版）[M].北京：化學工業出版社，2016：3.

[16]方芳，戴傳超，張波，等.茅蒼術懸浮細胞系建立及內生真菌誘導子對其揮發油積累的影響[J].中草藥，2009，40（3）：452-455.

[17]Fatima，S.，Mujib，A.and Tonk，D.NaCl Amendment Improves Vinblastine and Vincristine Synthesis in Catharanthus roseus：A Case of Stress Signalling as Evidenced by Antioxidant Enzymes Activities[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture （PCTOC），2015，121：445-458.

[18]宋剛，沈菲，王慶濤，等.茅蒼術無菌培養體系的構建[J].江蘇農業科學，2013，41（11）：46-47.

[19]巢建國，談獻和，張瑜，等.茅蒼術快速繁殖[J].中藥材，2001，24（7）：8-9.

[20]王紅娟，楊嵐 向增旭.藥用植物茅蒼術工廠化育苗關鍵技術研究[J].藥物生物技術，2014，21（2）：152-155.

[21]李西騰，吳沿友.茅蒼術的組織培養和快速繁殖[J].廣西熱帶農業，2006（2）：33-34.

[22]李鴻盛，劉夢茹，侯文秋，等.藥用植物茅蒼術快繁及組織培養技術初探[J].分子植物育種，2019，17（5）：1611-1615.

[23]劉海萍，巢建國.藥用植物茅蒼術的組織培養[J].現代中藥研究與實踐，2005，19（5）：11-13

[24]宋剛，曹正，宋金耀，等.茅蒼術愈傷組織誘導及其分化培養研究[J].安徽農業科學，2015，43（27）：39-40，43.

[25]宋剛，徐銀，史俊，等.茅蒼術規模化組培快繁體系的建立[J].江西農業學報，2018，030（009）：63-67.

[26]路成，王雷.美女櫻種子誘導芽組織培養[J].分子植物育種，2021，3（5）：1-18.

[27]鞏振輝，申書興.植物組織培養（第二版）[M].北京：化學工業出版社，2016：3.

[28]段留生，田曉莉.作物化學控制原理與技術（第2版）[M].北京：中國農業大學出版社，2011.

[29]王三根，蒼晶.植物生理生化（第三版）[M].北京：中國農業出版社，2020.

（責編：張宏民）