雷公藤多苷通過PI3K/Akt通路對糖尿病腎病大鼠熱休克蛋白90及PGC-1α表達的影響*

于向慧，何艷玲，楊雨菲，張庚良，馮曉辭

（1.河北省中醫院內分泌科，河北石家莊 050032；2.河北中醫學院，河北石家莊 050091）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy, DN）是由高糖微環境引起的多種病理機制協同作用導致的腎組織細胞凋亡和纖維化，表現為腎功能逐漸下降[1]。目前關于DN 的發病機制仍不明確，有研究認為高糖微環境激活PI3K/Akt 通路，促進炎癥細胞因子等基因轉錄，導致細胞凋亡和纖維化[2]。熱休克蛋白（heat shock protein, HPS）是分子伴侶蛋白的一個家族，參與蛋白質折疊和穩定化，其中HSP90 是最豐富的一種，各種壓力條件（如高糖、高溫、缺氧等）均可誘導HSP90 的活化[3]。最新研究發現，DN 患者HPS90 明顯上調，但是其在DN 中的作用機制和調控方式仍不明確[4]。過氧化物酶體增殖物激活受體- γ 共激活因子-1α（peroxisome proliferatoractivated receptor-γ coactivator-1α, PGC-1α）可通過調控線粒體功能調節活性氧自由基，進而參與DN 的發生、發展[5]。雷公藤多甙（tripterygium glycosides, TG）是從傳統中藥雷公藤中提取的一種化合物，有緩解腎組織損傷的作用[6]。近年來研究顯示，TG 對DN 也具有治療作用[7]。也有研究顯示，TG 可通過抑制PI3K/Akt 通路，緩解甲狀腺氧化應激狀態[8]，但是TG 是否通過PI3K/Akt緩解DN，以及是否對HSP90 和PGC-1α 產生影響仍不清楚。本文主要分析TG 通過PI3K/Akt 通路對DN 大鼠HSO90、PGC-1α 水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型復制及分組

65 只SD 大鼠SPF 級，雄性，12 周，體重220～250 g，購自華北制藥股份有限公司。實驗動物生產許可證號：SCXK（冀）2019-004，實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2019-011。取50 只SD 大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（60 mg/kg，pH=4.5）復制DN模型[9]。注射后第3 天抽取大鼠檢測尾靜脈血檢測空腹血糖，空腹血糖＞16.67 mmol/L 證明糖尿病模型復制成功。繼續飼養4 周后，收集大鼠尿液檢測尿微量白蛋白，以尿微量白蛋白＞15 μg/ml 確定DN 模型復制成功。本研究模型復制成功率為92.00%（46/50）。隨機選擇45 只模型復制成功的大鼠分為DN 組、DN+TG組和DN+TG+SC79組，每組15只；選擇15只健康大鼠作為對照組。DN+TG 組和DN+TG+SC79 組大鼠TG 灌胃，根據人體和大鼠體質量換算出劑量為20 mg/kg，1 次/d[10]。DN+TG+SC79 組大鼠腹膜內注射SC79 以激活PI3K/Akt 通路[11]，劑量為0.04 mg/g，2 次/周。連續干預4 周后進行實驗。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素（上海如吉生物科技發展有限公司），PI3K/Akt通路激動劑SC79（S7863）（上海碧云天生物技術有限公司），酶聯免疫吸附試驗試劑盒（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）（南京森貝伽生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）和Masson染色試劑盒、RNAspin Mini 和miRNeasy Mini 試劑盒、Bestar qRT-PCR 和Bestar qRT-PCR 試劑盒、TaqMan miRNA試劑盒、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000 稀釋，#ab6721）、硝酸纖維素膜、電化學發光（electrochemiluminescence,ECL）顯色試劑盒購自廣州易錦生物技術有限公司。SMT100V小動物自動生化分析儀、顯微鏡購自上海易畢恩生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腎功能指標和炎癥因子通過SMT100V 小動物自動生化分析儀檢測大鼠24 h 尿蛋白和肌酐，評估腎功能。收集大鼠尾靜脈血，2 000 r/min 離心20 min，收集上層血清，用ELISA 試劑盒檢測白細胞介素1β（Interleukin-1β, IL-1β）和IL-6，用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值，然后根據標準曲線計算IL-1β 和IL-6 水平。

1.3.2 HE 染色大鼠安樂死后取出腎組織并在室溫條件下用4%多聚甲醛固定6 h。乙醇脫水（從低濃度到高濃度）后，將組織包埋在石蠟中，制作5 μm 厚的切片，固定在載玻片上。載玻片在室溫條件下用蘇木精染色10 min，自來水洗滌1～2 min后將載玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍。隨后用自來水清洗1～2 min后將載玻片放入曙紅中10 s。用乙醇（濃度分別為70%、90%、95%和100%）脫水后，將載玻片置于二甲苯中2 min；重復此步驟1 次。最后用中性膠密封玻片，在倒置顯微鏡下觀察大鼠腎組織損傷情況。

1.3.3 Masson 染色將腎組織固定在10%中性甲醛緩沖液，石蠟包埋、切片（厚約4 μm），用Masson三色染色劑染色，以檢測腎間質纖維化的面積。2位研究人員使用IDA-2000 高分辨率數字顯微鏡和圖像分析系統，在400 倍放大鏡下評估每個視野的纖維化面積百分比。

1.3.4 Western blotting 檢測HPS90 和PGC-1α 蛋白表達將腎組織置于RIPA 裂解緩沖液中，冰上裂解。通過8% SDS-PAGE 分離每個樣品中等量（50 μg）蛋白，并將其轉移到硝酸纖維素膜上。室溫條件下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h，封閉非特異性抗原。膜與一抗體在4℃條件下孵育過夜，然后將膜與相應的辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL 顯色試劑盒顯色，Quantum One 軟件分析灰度，計算蛋白相對表達量。

1.3.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測HPS90 和PGC-1α mRNA 表達采用RNeasy Mini試劑盒提取腎組織總RNA，Bestar qRT-PCR 試劑盒逆轉錄為cDNA，條件如下：37℃15 min，98℃5 min。采用Bestar?qRT-PCR 預混液進行qRT-PCR實驗，反應條件：95℃預變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共計40 個循環，72℃繼續延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統進行qRT-PCR 分析。通過比較循環閾值并以GAPDH 作為內參，計算mRNA 相對表達量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析或t檢驗，多組間進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖水平比較

各組大鼠干預前的血糖水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；各模型組大鼠干預前血糖均高于對照組，且＞16.67 mmol/L。各組大鼠干預后的血糖水平比較，經方差分析，差異有統計學意義義（P＜0.05）；DN+TG 組、DN+TG+SC79 組低于DN 組（P＜0.05）。對照組、DN 組大鼠干預前后的血糖水平比較，經t檢驗，差異無統計學意義（t=0.842 和0.126，P=0.412 和0.106）。DN+TG 組、DN+TG+SC79 組大鼠干預前后的血糖水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=35.058 和36.821，均P=0.000），干預后血糖降低。見表2。

表2 各組大鼠空腹血糖水平比較（n=15，mmol/L，±s）

表2 各組大鼠空腹血糖水平比較（n=15，mmol/L，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值干預前4.96±0.55 29.05±2.44 29.67±2.21 30.21±2.38 28.763 0.001干預后4.52±0.51 30.11±2.84 22.05±2.15 23.97±2.34 30.237 0.001

2.2 TG對大鼠腎組織損傷的影響

對照組腎小球和腎小管正常；DN組腎小球出現水腫和炎癥浸潤，結構出現異常，腎小球膨大；DN+TG組腎小球結構基本完整，水腫和炎癥浸潤有所緩解；DN+TG+SC79組腎小球損傷情況與DN組類似。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織損傷情況 （HE染色×400）

2.3 TG對大鼠腎功能的影響

各組大鼠腎功能指標比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：DN 組24 h 尿蛋白和肌酐高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組的24 h 尿蛋白和肌酐高于DN+TG 組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠腎功能指標比較 （n=15，±s）

表3 各組大鼠腎功能指標比較 （n=15，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值24 h尿蛋白/mg 24.57±3.85 248.16±30.28 126.92±19.74 238.24±31.06 25.179 0.001肌酐/（μmol/L）28.35±3.96 55.42±7.47 39.38±5.58 52.51±7.43 23.731 0.001

2.4 TG對大鼠腎纖維化的影響

對照組、DN 組、DN+TG 組、DN+TG+SC79 組的腎組織纖維化面積百分比分別為（3.74±0.45）%、（21.77±2.06）%、（7.94±0.91）%和（19.32±1.89）%，經方差分析，差異有統計學意義（F= 27.356，P=0.001）。進一步兩兩比較結果：DN 組高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組高于DN+TG 組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠腎纖維化情況 （Masson染色×400）

2.5 各組大鼠PI3K/Akt通路激活情況

各組大鼠腎組織中PI3K/Akt 通路激活情況比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：DN 組p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 高于DN+TG 組（P＜0.05）。見表4和圖3。

圖3 各組大鼠腎組織中PI3K/Akt通路的表達

表4 各組大鼠PI3K和Akt磷酸化水平比較（n=15，±s）

表4 各組大鼠PI3K和Akt磷酸化水平比較（n=15，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值p-PI3K/PI3K 0.56±0.05 2.97±0.25 1.17±0.10 2.06±0.17 19.765 0.001 p-Akt/Akt 0.41±0.04 2.18±0.19 1.05±0.09 1.84±0.16 22.124 0.001

2.6 TG對大鼠腎組織HSP90、PGC-1α轉錄水平的影響

各組大鼠腎組織HSP90、PGC-1α mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：DN 組HSP90 mRNA相對表達量高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05），而PGC-1α mRNA 相對表達量低于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組HSP90 mRNA 相對表達量高于DN+TG 組（P＜0.05），而PGC-1α mRNA 相對表達量低于DN+TG 組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠HSP90和PGC-1α mRNA相對表達量比較 （n=15，±s）

表5 各組大鼠HSP90和PGC-1α mRNA相對表達量比較 （n=15，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值HSP90 mRNA 0.94±0.09 4.89±0.45 3.01±0.28 4.74±0.45 15.764 0.001 PGC-1α mRNA 4.72±0.43 0.91±0.09 3.54±0.41 1.45±0.22 14.987 0.001

2.7 TG對大鼠腎組織HSP90、PGC-1α蛋白表達的影響

各組大鼠腎組織HSP90 和PGC-1α 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：DN 組HSP90 蛋白相對表達量高于對照組和DN+TG 組（P＜0.05），而PGC-1α 蛋白相對表達量低于對照組和DN+TG 組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組HSP90 蛋白相對表達量高于DN+TG 組，而PGC-1α 蛋白相對表達量低于DN+TG 組（P＜0.05）。見表6和圖4。

表6 各組大鼠HSP90和PGC-1α蛋白相對表達量比較（n=15，±s）

表6 各組大鼠HSP90和PGC-1α蛋白相對表達量比較（n=15，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值HSP90蛋白0.62±0.06 3.64±0.32 2.31±0.21 3.38±0.30 19.765 0.001 PGC-1α蛋白2.53±0.21 0.58±0.05 2.06±0.18 0.91±0.09 17.432 0.001

圖4 各組大鼠腎組織HSP90和PGC-1α蛋白的表達

2.8 TG對大鼠IL-1β、IL-6水平的影響

各組大鼠炎癥因子水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：DN 組IL-1β、IL-6 水平高于對照組和DN+TG組（P＜0.05）；DN+TG+SC79 組IL-1β、IL-6 水平高于DN+TG 組（P＜0.05）。見表7。

表7 各組大鼠IL-1β、IL-6水平比較（n=15，pg/mL，±s）

表7 各組大鼠IL-1β、IL-6水平比較（n=15，pg/mL，±s）

組別對照組DN組DN+TG組DN+TG+SC79組F 值P 值IL-1β 14.67±2.01 86.32±9.65 38.76±4.63 80.77±9.44 23.087 0.001 IL-6 24.21±2.86 96.75±9.39 49.02±5.67 91.34±10.43c 22.456 0.001

3 討論

全世界超過4億人患有糖尿病，每年死亡370萬人[12]。長期高血糖會損害器官的小血管，主要包括眼睛、腎臟和神經。在許多國家，DN 是導致終末腎臟疾病最常見的原因，表現為腎小球肥大、蛋白尿和腎小球膜細胞分泌的細胞外基質（extracellular matrix, ECM）成分積累。在DN 中，促炎癥細胞因子（如IL-1β 和IL-6 等）水平升高，影響腎單位的轉運蛋白和離子通道的功能，并導致腎臟纖維化和腎小球硬化。腎小球功能性細胞喪失與ECM 蛋白（尤其是間質膠原蛋白，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原蛋白）過度積累密切相關，腎纖維化是DN進展的關鍵機制，也是導致腎功能喪失的主要原因[13]。但是目前尚無治療DN 的有效方法。

有研究顯示，PI3K/Akt 在DN 中發揮重要作用，PI3K 和Akt 被磷酸化激活后，進入細胞核調節轉錄，從而促進炎癥因子和ECM 等的表達，損傷腎功能[14-15]。中藥在治療DN 中取得了長足的發展，有研究表明中藥可通過抑制PI3K/Akt 通路，緩解DN，保護腎功能[16]。TG 是從雷公藤根木質部提取和純化的活性物質，已被廣泛用于治療自身免疫和炎癥疾病，包括類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡及腎病綜合征等[17]。并且近年來也有生物信息學研究結果顯示，TG 具有緩解糖尿病引起的器官纖維化的作用，從而緩解包括DN 在內的糖尿病并發癥[18]，但是TG 是否通過PI3K/Akt 通路對DN 腎功能和纖維化具有緩解作用仍未明確。本研究通過TG 灌胃干預DN 小鼠，并通過SC79 激活PI3K/Akt通路，SC79 可作為促進動物模型中PI3K 和Akt 磷酸化的試劑[19]。結果顯示TG 能夠明顯緩解DN 大鼠的腎組織損傷和纖維化，保護腎功能。通過Western blotting 結果檢測證實DN 大鼠模型腎組織中PI3K 和Akt 蛋白磷酸化水平明顯升高，而TG 可顯著抑制PI3K/Akt 通路的激活，SC79 可使PI3K 和Akt磷酸化水平恢復。并且本研究結果還表明，使用SC79 激活PI3K/Akt 通路后，TG 對腎組織的保護作用被阻斷。有研究發現，TG 可通過抑制PI3K/Akt通路，提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[20]。陳婷等[21]研究發現TG 可通過減少PI3K 和Akt 磷酸化水平，抑制青光眼手術后的纖維化。有研究顯示TG也具有降低血糖的作用，但是其對血糖的影響有限，干預后血糖濃度依舊＞16.67 mmol/L，這對保護腎臟組織作用輕微。這提示在DN 中，TG 可能通過抑制PI3K/Akt 通路的激活，保護腎組織并減少ECM的累積，從而保護腎功能。但是關于TG 抑制PI3K/Akt 后，通過何種分子機制緩解DN 仍不清楚。

PI3K-Akt 信號通路的活性可以被類脂磷酸酶PTEN 和SHIP 負調節，但迄今為止尚未發現下調Akt 活性的特異磷酸酶，而用磷酸酶抑制劑處理細胞后，Akt 的磷酸化和活性均有所增加。最近發現HSP90 能結合Akt，阻止Akt 被PP2A 磷酸酶的去磷酸化而失活，因此具有保護Akt 的作用。另外激活PI3K/Akt 可磷酸化Sirt1，隨后Sirt1 乙酰化激活PGC-1α 從而發揮其作用。為進一步分析TG 通過PI3K/Akt 緩解DN 的作用機制，本文檢測了HSP90和PGC-1α 表達。HSP90 的表達可被PI3K/Akt 通路上調[22]，體外研究也顯示高糖環境下腎小管細胞中HSP90 升高，其過表達加速細胞損傷[23]。而抑制HSP90 可使DN 大鼠IL-6 等炎癥因子水平降低，保護腎臟功能[24]。PGC-1α 具有保護線粒體、緩解氧化應激和抗纖維化作用[25]，并且與PI3K/Akt 之間存在串擾，兩者互相調控[26]。有研究結果顯示，中藥在緩解DN 的同時還會促進PGC-1α 的表達[27]。本研究結果顯示，DN 組大鼠腎組織中HSP90 表達及炎癥細胞因子水平均顯著升高，而PGC-1α 表達降低，TG 能夠抑制HSP90 表達和降低炎癥因子，并促進PGC-1α 的表達，而使用SC79 激活PI3K/Akt后，TG 抑制HSP90 表達和降低炎癥因子水平，以及促進PGC-1α 表達的作用被阻斷。有研究發現，TG 可通過抑制HSP90 的表達改善腎病綜合征患者腎功能[9]。最新研究表明，雷公藤的活性提取物可通過促進PGC-1α 的轉錄和翻譯緩解炎癥反應，進而調控細胞代謝，保護細胞[28]。提示DN 的發生可能與PI3K/Akt 促進HSP90 表達，抑制PGC-1α 表達有關，而TG 可能通過激活PI3K/Akt 通路，調節p-Akt 的轉錄調節功能，進而抑制HSP90 的轉錄和翻譯，促進PGC-1α 的表達，起到緩解DN 的作用。

綜上所述，TG 可以通過抑制PI3K/Akt 通路，抑制HSP90 的轉錄和翻譯，促進PGC-1α 的表達，并發揮抗炎和抗纖維化作用，從而緩解DN。