富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結石大鼠腎功能和氧化應激的影響及其機制研究*

高潔，常相帝，劉益濤，王雅寧，王海婷，董華

（濱州醫學院附屬醫院腎內科，山東濱州 256603）

腎結石是臨床常見的并發癥及多發疾病，其中腎草酸鈣結石是其常見類型，發病率較高，可嚴重影響患者腎功能。目前，微創手術及體內碎石均是治療腎草酸鈣結石的常用手段，但術后患者常出現較多并發癥，且容易復發，因此尋找新的治療手段抑制結石形成及結石沉積具有重要臨床意義[1]。富馬酸二甲酯是用于多發性硬化癥疾病的基礎藥物，可激活內源性抗氧化和抗炎通路。腎草酸鈣結石發病機制復雜，有研究表明腎臟氧化應激損傷是導致其病情進展的關鍵因素之一[2]。馬志強等[3]研究顯示，富馬酸二甲酯可以有效降低腎草酸鈣結石大鼠草酸鈣晶體含量，并抑制大鼠氧化應激損傷。絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）通路是活性氧敏感的信號轉導通路之一，其家族成員JNK、p38 與氧化應激反應有關[4]。解斌等[5]研究顯示，p38 MAPK 通路能夠促進腎小管上皮細胞氧化應激反應，引起腎結石。目前，富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結石大鼠腎功能及氧化應激的改善作用是否與p38 MAPK通路有關的報道較少。因此本研究基于p38 MAPK信號通路探討富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結石大鼠腎功能及氧化應激的改善作用，以期為臨床治療腎草酸鈣結石提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

30只SPF級、10周齡SD雄性大鼠，體質量190～240 g，平均（209±25）g，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0009；實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2019-0006。

1.2 主要材料及儀器

富馬酸二甲酯（規格5 mg，純度≥98%）購自深圳海思安生物技術有限公司，核固紅染料購自北京伊塔生物科技有限公司，超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase, SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（malonaldehyde, MDA）檢測試劑盒購自上海莼試生物技術有限公司，活性氧（reactive oxygen species, ROS）測定試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒購自上海滬震實業有限公司，蛋白提取試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司，兔抗鼠p-JNK、JNK、p38、p-p38 及β-actin 多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗購自上海鈺博生物科技有限公司。Optima?XPN 超速離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司，CX31-P 型偏振光光學顯微鏡購自深圳市博視達光學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及腎草酸鈣結石模型的復制將大鼠隨機分為對照組、模型組、富馬酸二甲酯組，每組10 只。模型組及富馬酸二甲酯組大鼠均腹腔注射0.25% L-羥脯氨酸2.5 kg/（kg·d），連續7 d，誘導腎草酸鈣結石大鼠模型，尿鈣水平升高表明模型復制成功[6]。富馬酸二甲酯組大鼠腹腔注射富馬酸二甲酯25 mg/（kg·d），連續28 d；對照組、模型組同時腹腔注射等量生理鹽水。期間觀察大鼠一般情況。

1.3.2 標本采集于最后一次腹腔注射給藥前1 d，用代謝籠收集3 組大鼠尿液標本，于最后一次腹腔注射給藥后1 h 腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取尾靜脈血2 ml，3 000 r/min 離心10 min 后取上清，置入-80℃冰箱冷凍保存，用于檢測腎功能指標。3 組大鼠取血完成后處死并取雙腎，其中左腎保存于-80℃冰箱待測；右腎用4%多聚甲醛固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續切片約6 μm 厚，用于后續檢測。

1.3.3 腎功能指標檢測取3 組大鼠尿液及血液，采用全自動生化分析儀檢測尿液中尿蛋白、尿鈣，以及血液中血肌酐水平，共重復10次[7]。

1.3.4 HE染色取3 組大鼠右腎組織切片，常規脫蠟、水化后行HE 染色，偏振光光學顯微鏡下觀察腎組織草酸鈣晶體沉積情況。觀察5 個視野中大鼠腎組織腎小管草酸鈣晶體形成情況并拍照，統計每個視野草酸鈣晶體數量，取平均值，共重復10 次[8]。

1.3.5 大鼠腎組織氧化應激水平檢測取3 組大鼠部分左腎組織，制備組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min 后取上清，分別采用SOD 活性檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒及ROS 檢測試劑盒檢測血清SOD 活性，MDA、ROS水平，共重復10次[9]。

1.3.6 Western bloting檢測大鼠腎組織p38 MAPK通路蛋白相對表達量取3 組大鼠剩余左腎組織，制備組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min，用RIPA 液冰上裂解，孵育20 min 后3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液測定蛋白總量，取20 μg 上清液與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴變性，進行電泳、轉膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 清洗，加入p-JNK、JNK、p-p38、p38 及β-actin 作為一抗（1∶500），4℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入山羊抗兔二抗（1∶1 000），37℃條件下放置1.5 h 后顯影、定影，計算各蛋白相對表達量，共重復10 次[10]。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

模型組和富馬酸二甲酯組大鼠均成功復制腎草酸鈣結石模型。對照組大鼠整體狀態良好，皮毛光亮，行動靈活，飲水飲食及大小便均正常；模型組大鼠精神萎靡，皮毛泛黃，慵懶，飲食飲水變少；富馬酸二甲酯組大鼠上述一般情況較模型組有一定程度的改善。

2.2 各組大鼠腎功能比較

3 組大鼠尿蛋白、尿鈣、血肌酐水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與對照組相比，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠尿蛋白、尿鈣、血肌酐水平升高（P＜0.05）；但富馬酸二甲酯組大鼠尿蛋白、尿鈣、血肌酐水平低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腎功能比較 （n=10，±s）

表1 各組大鼠腎功能比較 （n=10，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組富馬酸二甲酯組F 值P 值血肌酐/（μmol/ml）10.05±1.56 20.23±3.09①15.79±2.38①②44.286 0.000尿蛋白/（mg/ml）2.06±0.31 12.33±1.90①7.98±1.12①②160.711 0.000尿鈣/（mg/ml）0.31±0.05 3.30±0.50①1.97±0.31①②193.124 0.000

2.3 各組大鼠腎組織草酸鈣晶體含量比較

對照組大鼠腎小管結構正常，未見草酸鈣結晶；模型組大鼠大部分腎小管擴張，可見較多草酸鈣結晶；富馬酸二甲酯組大鼠部分腎小管擴張，可見草酸鈣結晶，但較模型組少。見圖1。

模型組、富馬酸二甲酯組大鼠腎組織草酸鈣晶體含量分別為（71.66±10.75）個和（43.51±6.53）個，經t檢驗，差異有統計學意義（t=247.172，P=0.000），富馬酸二甲酯組較少。

2.4 各組大鼠腎組織氧化應激水平比較

3組大鼠SOD活性，MDA、ROS水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠SOD活性降低，MDA、ROS水平升高（P＜0.05）；但富馬酸二甲酯組大鼠SOD 活性高于模型組，MDA、ROS 水平低于模型組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腎組織氧化應激水平比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠腎組織氧化應激水平比較 （n=10，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組富馬酸二甲酯組F 值P 值ROS/%67.93±10.20 156.06±23.41①95.77±15.30①②68.706 0.000 SOD/（u/mg）1.37±0.21 0.55±0.09①0.93±0.15①②67.631 0.000 MDA/（nmol/mg）2.67±0.40 9.82±1.47①5.67±0.86①②126.360 0.000

2.5 各組大鼠腎組織p38 MAPK 通路蛋白相對表達量比較

3 組大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與對照組相比，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠p-JNK、p-p38蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；但富馬酸二甲酯組大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相對表達量低于模型組（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3 各組大鼠腎組織p38 MAPK信號通路蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠腎組織p38 MAPK信號通路蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組富馬酸二甲酯組F 值P 值p-p38 0.45±0.07 1.23±0.19①0.85±0.13①②78.826 0.000 p-JNK 0.37±0.06 1.05±0.16①0.79±0.12①②81.009 0.000

圖2 各組大鼠腎組織p38 MAPK信號通路蛋白的表達

3 討論

腎結石是泌尿系統常見疾病之一，其中腎草酸鈣結石發病率較高，患者可出現腎積水及腎盂腎炎，嚴重情況下導致腎衰竭，且腎結石患者會出現劇痛，給身體健康帶來嚴重危害[11]。近年來，臨床多采用微創手術、體外碎石等方式治療腎結石，但術后易復發且具有較多并發癥[12]。富馬酸二甲酯是治療多發性硬化癥的新藥，其有保護細胞和抗炎作用[13]。徐震等[14]研究顯示，富馬酸二甲酯可能通過抑制腎臟氧化應激反應，對小鼠腎缺血再灌注損傷發揮保護作用。有報道顯示，富馬酸二甲酯可抑制腎草酸鈣結石的發生、發展[3]。目前，富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結石治療作用的具體機制尚未明確。

血肌酐升高常表明腎功能受損，而腎功能損傷的關鍵因素之一是分泌大量尿蛋白[15]。草酸鈣晶體是影響尿結石的主要原因之一，對腎臟上皮細胞產生毒性作用[16]。本研究結果表明，富馬酸二甲酯對腎草酸鈣結石大鼠腎功能有一定改善作用。有研究表明，草酸鈣晶體附著的腎小管上皮細胞氧化應激損傷是草酸鈣腎結石發生、發展的主要原因之一[17]。正常機體中，氧自由基生成-清除處于平衡狀態，病理狀態下該平衡被破壞，細胞內SOD 活性降低，使ROS 升高，破壞細胞結構，生成大量MDA，檢測細胞外SOD 活性和MDA 水平可以反映細胞氧化應激損傷程度[18]。趙明等[19]研究顯示，抑制腎組織氧化應激反應能夠抑制腎草酸鈣結石形成進展。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠SOD 活性降低，MDA、ROS 水平升高；但富馬酸二甲酯組大鼠SOD活性高于模型組，MDA、ROS 水平低于模型組，說明富馬酸二甲酯可能通過抑制腎組織氧化應激反應，抑制腎草酸鈣結石形成進展。

MAPK 通路是一種氧化應激轉導通路，通常由JNK、p38 通路及細胞外信號調節激酶等通路組成[20]。王博涵等[21]研究顯示，抑制p38 MAPK 通路活化可有效抑制腎小管上皮細胞氧化應激損傷，進而抑制黏附性尿石形成。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組和富馬酸二甲酯組大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相對表達量升高；但富馬酸二甲酯組大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相對表達量低于模型組，與既往研究結果一致[20-21]。

綜上所述，富馬酸二甲酯可能通過抑制p38 MAPK 通路活化，抑制腎臟組織氧化應激反應，從而抑制腎草酸鈣結石形成，進而保護腎功能。而本研究并未能明確富馬酸二甲酯對p38 MAPK 通路的具體調控作用，有待后期深入研究。