著絲粒蛋白U在肝細胞癌中的表達及其臨床意義*

陳靜 胡進靜 李汛,,3,4,5 王海平 張璐

(1.蘭州大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省生物治療與再生醫學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學第一醫院普外科，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州大學醫學院腫瘤防治中心，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅省肝膽胰外科研究所，甘肅 蘭州 730000)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發病率及死亡率高[1]。由于肝癌早期發病隱匿，臨床表現不明顯，確診時已是晚期[2]。肝癌的發生和發展與腫瘤抑制基因的丟失和癌基因的激活有關[3]。目前尚不清楚其潛在的分子機制。因此，迫切需要探索具有高特異性和敏感性的有效生物標志物用于肝癌的診斷和預后，從而改善肝癌的生存率。著絲粒蛋白U(Centromere protein U，CENPU)是2004年首次發現的一種著絲粒結合蛋白，是著絲粒-動粒復合體(Centromere kinetochore complex，CKC)重要組成部分，若其發生異常或缺乏會導致CKC結構及功能發生變化，染色體不穩定性增加，導致基因組突變，從而引起腫瘤的發生[4-5]。目前越來越多的研究表明，CENPU表達的異常是許多腫瘤共有的特征，其可在多種惡性腫瘤中呈高表達，參與腫瘤的增殖、遷移、侵襲及凋亡等過程，其高表達與惡性腫瘤的不良預后密切相關[6-15]。但關于CENPU在肝癌的發生和發展中的作用未知。本研究首先通過TCGA數據庫預測CENPU在HCC患者中表達情況及其與HCC患者預后的關系，進一步通過免疫組化驗證CENPU蛋白表達水平與肝癌的關系及對預后的影響，以評價CENPU是否可作為監測HCC患者預后標志物的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010～2012年在蘭州大學第一醫院行肝腫瘤切除術并經病理證實為肝細胞肝癌的患者中選擇80例患者的臨床病理特征相關數據，包括年齡、性別、肝功能、Child-Pugh分級、腫瘤大小、分化程度、包膜、淋巴結受累、血管侵犯、治療方案等。納入標準：所有患者術前和術后復發前未行化療、放療、介入治療、消融治療或靶向治療，影像學檢查結果確定有無轉移、腫瘤位置，術后病理學檢查證實為原發性HCC。排除標準：繼發性肝細胞癌、合并其他慢性疾病者等。并對于納入患者的基線特征進行表述并與人群特征進行比較，確認納入患者與人群的臨床病理特征無顯著性差異。所有患者在研究前均已簽署知情同意書。所有患者均經隨訪至患者死亡。該研究獲得蘭州大學第一醫院倫理委員會的批準，根據機構審查委員會的規程，每位患者均獲得了知情同意。研究方案符合1975年《赫爾辛基宣言》的道德準則。

1.2 數據下載 研究中使用的529例肝癌患者(其中有371例癌組織和50例正常組織)CENPU基因測序信息及臨床信息來源于UALCAN在線數據庫(數據來源于TCGA數據庫)，比較兩種組織中CENPU mRNA表達量的差別。同時，根據RNA seq數據，以CENPU mRNA表達量的中位數為界將肝細胞癌分為高表達與低表達兩組，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，總生存時間從疾病診斷開始計算至患者死亡。無病生存率分析CENPU對肝癌患者的預后價值。

1.3 免疫組化 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3 min微波爐對組織抗原進行修復，具體步驟按照文獻操作[16]。抗體(Gene Tex，Cat No.GTX48708)。免疫組化結果均由2位病理醫師獨立進行評估，以保證結果的真實性。CENPU為細胞漿及胞核著色，評分采用陽性細胞比例方法：0分<5%；1分6%～35%；2分36%～70%；3分> 70%。為了進一步明確CENPU蛋白表達水平與HCC患者的臨床病理特征之間的相關性，根據CENPU蛋白的表達量進行分組，高表達(2分或者3分)，低表達(0分或則1分)，見圖1。

圖1 肝癌組織中CENPU的代表性免疫染色圖片

2 結果

2.1 CENPU mRNA在肝癌組織中表達情況 CENPU mRNA在HCC患者肝癌組織中的表達水平明顯高于正常肝組織，差異具有統計學意義(P<0.0001)，見圖2A；且在HCC患者，按不同病理分期分為4組，病理分級采用Edmondson-Stein方法，CENPU的mRNA在肝癌組織中的表達量隨著病例分級逐次遞增，見圖2B。

圖2 在UALCAN數據庫分析CENPU mRNA表達情況

2.2 HCC組織中CENPU蛋白與臨床病理特征的關系 CENPU的蛋白表達量與腫瘤患者年齡、性別、病理分級、腫瘤大小、腫瘤數目、肝硬化結節的數目、腫瘤包膜是否完整、腫瘤的分期及分級、是否具有HBsAb、是否感染HBV及HCV、生化指標均無關系(P>0.05)，見表1。

表1 CENPU不同表達量與臨床病理指標相關性分析

2.3 CENPU蛋白在HCC患者中表達與患者生存期的關系 首先通過GEPIA在線數據庫預測分析顯示，生存曲線結果顯示低表達組總生存期(OS)以及無瘤生存期(DFS)顯著高于高表達組(P<0.05)，見圖3。根據TCGA的數據結果初步可知CENPU在HCC患者的高低表達可作為HCC患者的與肝癌患者的預后具有一定的相關性。前述免疫組化染色強度評分方法，有7.6%(6/79)的HCC組織顯示陰性(0分)，38%(30/79)的HCC組織顯示弱陽性(1分)，40.5%(32/79)的HCC組織中顯示中度染色(2分)，13.9%(11/79)的HCC組織呈現強陽性(3分)。在79例病理組織中低表達人數有36例(45.6%)，高表達有43例(54.4%)，比較差異無統計學意義(P=0.072)。CENPU蛋白在肝癌中高表達組患者的總生存期低于低表達組患者的生存期(P=0.023)，見圖4。但CENPU蛋白的高低表達與HCC患者的無瘤進展期無相關性(P=0.184)。

圖3 肝癌患者中CENPU的mRNA上調與預后不良有關

圖4 基于CENPU蛋白表達水平的HCC患者生存曲線

2.4 肝癌總生存率預后指標的單因素和多因素Cox比例風險回歸分析 進一步采用Cox比例風險回歸進行單因素分析發現，CENPU表達水平、病理分期、GGT是HCC患者總生存期的危險因素。多因素分析顯示，CENPU表達水平、病理分期、GGT顯示是影響HCC患者總生存期的因素，見表2。

表2 肝癌總生存率預后指標的單因素和多因素Cox比例風險回歸分析

3 討論

肝癌為發病率和死亡率都極高的惡性腫瘤，近年來從發病危險因素分析到早期診斷、療效監測和預后評估的分子標志物的尋找，再到放化療耐藥機制的探討，以及靶向藥物的研發成為了研究的熱點，并且取得了一定的進展[17-19]。HCC的發生、發展主要由復雜的遺傳因素(遺傳風險因素、基因變異等)和環境因素協同作用，共同促進肝炎-肝硬化-肝癌的轉變效應[20]。因此找到預測患者預后的指標，亦或者尋找潛在的治療靶點，是有效提高肝癌患者生存期的途徑。

課題組前期通過加權基因共表達網絡(Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)方法研究肝細胞癌(HCC)中肝癌干細胞相關基因表達及其與預后的相關性[21]。我們通過進一步的篩選發現CENPU與肝癌患者的預后密切相關。CENPU是一種著絲粒結合蛋白，在整個細胞周期中都被定位在著絲粒中,被確認為著絲粒的組成成分，在細胞周期進程中發揮重要作用。CENPU基因在多種惡性腫瘤中呈高表達，其在多種癌癥中過表達與腫瘤的不良預后密切相關，但在肝癌中尚無關于其與患者預后影響的相關研究，遂本實驗展開了相關研究，以期了解CENPU是否是影響HCC患者預后的因素，是否可以作為監測HCC患者不良預后的指標。

本研究首先通過UALCAN在線數據庫預測其mRNA水平高表達與HCC患者不良預后相關，提示其可能作為一種促癌基因參與到肝癌的進展中，導致疾病的進展，從而降低患者生存期。這與膀胱癌、腔內乳腺癌組織中的結果相一致[11,22]，CENPU較鄰近的正常組織表達顯著上調，并且CENPU高表達與患者預后不良相關[12,23]。Wan等[24]通過基于生物信息學的分析鑒定CENPU是與肝細胞癌相關的新基因，其可能為監測肝細胞癌的一種潛在標志物，而在此前是否參與致癌作用，需要進一步的分子生物學來探討其參與肝癌的分子機制。Wang等[25]在探索具有可能用作血清/血漿生物標志物的新型circRNA及其在肝細胞癌(HCC)發病機理中發現CENPU是肝癌不良預后的指標。

本實驗進一步采用免疫組織化學染色法驗證CENPU在蛋白水平上表達情況。通過比較CENPU表達量與肝癌患者的臨床資料，發現其與患者的年齡、性別、病理分級、腫瘤大小及數目、AFP的表達量、腫瘤包膜是否完整、是否感染HBV及HCV以及生化指標等臨床基本特征均不相關。由于本研究標本數量較少，具有一定的偏倚性，所以需要進一步多中心、大樣本量進行驗證。而通過Kaplan-Meier分析發現，HCC組織中高表達CENPU患者總體生存率均顯著低于低表達者，表明HCC患者組織中CENPU表達水平和臨床預后緊密相關，有望應用到臨床上通過監測該指標，為患者預后評估予以一定的指導。Yang等[10]發現CENPU基因對細胞增殖、凋亡和細胞周期進程的影響，CENPU的表達水平與淋巴結轉移和腫瘤大小有關。本研究中通過Cox比例風險回歸單因素和多因素分析結果表明，CENPU表達水平、患者的病理分期、GGT指標可作為影響HCC患者總生存期的危險因素。本研究存在不足之處：其一，本次收集的樣本量較少，需要加大樣本量進行驗證；其二，未進行與正常患者肝組織標本進行比較，無法證實肝癌患者正常肝組織CENPU的表達量；其三，未進行相關分子生物水平上的機制研究，所以需要進一步研究CENPU在肝癌中具體機制以更好地指導其臨床應用。

4 結論

CENPU在HCC中表達明顯升高，與患者的病理分期、GGT指標相關，且其高表達者生存期降低，可能是影響肝癌患者不良預后的一個因素及治療的一個潛在靶點。