胞磷膽堿鈉堿降解雜質(zhì)的制備與結(jié)構(gòu)確證

王 鵬，許云強，孫宗彬，程戰(zhàn)立，劉金明，李鐵健，張貴民

（魯南制藥集團股份有限公司 國家手性制藥工程技術研究中心，山東 臨沂 276000）

胞磷膽堿鈉是合成細胞膜組分磷脂酰膽堿的中間體，為卵磷脂生物合成所需輔酶，目前廣泛應用于急性顱腦損傷及手術后的意識障礙[1]。在胞磷膽堿鈉注射液的質(zhì)量研究中，發(fā)現(xiàn)相對保留時間1.8倍處有一未知雜質(zhì)，其含量超過鑒定限，需對其進行研究。通過強制降解實驗發(fā)現(xiàn)，該雜質(zhì)含量在強堿性環(huán)境下能明顯變大，遂使用動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)對其進行分離制備，并對其進行結(jié)構(gòu)確證，以期為胞磷膽堿鈉注射液的質(zhì)量研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent）；NP7000型DAC-50動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)（漢邦科技）；85S2真空冷凍干燥機（美國Millrock）；R-220 pro型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi）；LAMBDA 365型紫外-可見分光光度計（美國PerkinElmer）；Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo）；AV400型核磁共振譜儀（德國Bruker）；SQD2液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters）。

1.2 試藥

胞磷膽堿鈉（山東新時代藥業(yè)，批號：183049）；甲醇，異丙醇（德國Merck，色譜純）；磷酸氫二鉀，磷酸（國藥集團，分析純）；四丁基氫氧化銨（Sigma，分析純）；氫氧化鈉，乙酸（西隴科學，分析純）；氘代二甲亞砜（美國CIL試劑，純度99.9 %）；乙腈（濰坊中匯，制備級）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析檢測條件

色譜柱為Welch XB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為磷酸鹽緩沖液[0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液和四丁基氫氧化銨（取0.01 mol/L四丁基氫氧化銨，用磷酸調(diào)pH 4.5）等量混合]:甲醇=95:5]，等度洗脫40 min；流速1 ml/min；柱溫25 ℃；檢測波長276 nm。該方法用于粗品溶液和雜質(zhì)制備過程中的分析檢測。

2.2 雜質(zhì)樣品溶液的配制

取胞磷膽堿鈉適量，加水溶解并制成每1 ml中含胞磷膽堿鈉10 mg的溶液，加入10 % 1 mol/L氫氧化鈉溶液，置90 ℃水浴加熱3 h，冷卻至室溫，加乙酸調(diào)至中性，得溶液A，作為雜質(zhì)樣品溶液。按2.1項下色譜條件檢測，目標雜質(zhì)色譜純度為29.58 %，分析圖譜見圖1。

圖1 雜質(zhì)樣品溶液的HPLC圖譜

2.3 目標雜質(zhì)的分離制備

2.3.1 制備柱裝填 取干燥的Sepax HP C18填料（10 μm，120 ?）300 g，置于燒杯中，緩慢加入異丙醇并同向攪拌，保持總體積約800 ml，超聲30 min進行勻漿。將勻漿液倒入DAC-50柱管中，調(diào)節(jié)氣閥大小，使氣壓保持0.4 Mpa進行制備柱裝填。保壓30 min后，以萘-甲醇溶液（1 mg/ml）2 ml為測試溶液，流動相為無水乙醇，流速50 ml/min，波長254 nm，檢測柱效，若N≥8000，柱效合格，若N＜8000，則柱效低，需按以上方法重新裝填至合格。

2.3.2 一次分離制備 制備液相色譜條件：流動相A為0.5 %乙酸，流動相B為乙腈，流速50 ml/min，檢測波長276 nm，梯度洗脫程序見表1。將2.2項下溶液A注入DAC-50動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，進樣體積6 ml，收集目標雜質(zhì)峰所對應的洗脫液，一次制備圖譜見圖2。一次制備收集液置40 ℃水浴中減壓旋蒸至約原體積的1/3，得溶液B，作為樣品溶液進行二次分離制備。

表1 一次分離制備梯度洗脫程序

圖2 一次分離制備圖譜

2.3.3 二次分離制備 制備液相色譜條件：流動相A為水，流動相B為乙腈，流速50 ml/min，檢測波長276 nm，洗脫程序見表2。將溶液B注入DAC-50動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，進樣體積20 ml，收集目標雜質(zhì)峰所對應的洗脫液，二次制備圖譜見圖3。二次制備收集液置40 ℃水浴減壓旋蒸至約原體積的1/2，得溶液C，作為待凍干樣品。

表2 二次分離制備梯度洗脫程序

圖3 二次分離制備圖譜

2.3.4 冷凍干燥 將溶液C倒于專用不銹鋼盤中，置于凍干板層，開啟真空冷凍干燥機，按表3程序進行凍干，凍干結(jié)束氮氣回填，氮氣保護出料，最終得到360 mg白色固體粉末。按2.1項下色譜條件檢測，目標雜質(zhì)色譜純度為96.34 %，分析圖譜見圖4。

表3 凍干程序

圖4 目標雜質(zhì)凍干樣品的HPLC圖譜

2.4 目標雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證

2.4.1 紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）分析 目標雜質(zhì)水溶液在205 nm和262 nm有較強吸收峰，兩處吸收峰分別為雜芳環(huán)E2帶和雜芳環(huán)B帶吸收，提示分子結(jié)構(gòu)中含雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)。

2.4.2 紅外光譜（IR）分析 KBr壓片法結(jié)果顯示分子結(jié)構(gòu)中含羥基、酰胺、甲基、磷酸酯和醚等結(jié)構(gòu)。其中：3411.93 cm-1處的吸收峰為羥基中氧氫鍵的伸縮振動特征吸收峰；1701.64 cm-1處的吸收峰為酰胺中碳氧雙鍵的伸縮振動特征吸收峰；1474.20 cm-1和1390.46 cm-1處的吸收峰為甲基中碳氫鍵的彎曲振動吸收峰；1264.86 cm-1和1109.29 cm-1處的吸收峰為磷酸酯中磷氧雙鍵的伸縮振動吸收峰；1055.16 cm-1處的吸收峰為醚中碳氧碳單鍵的伸縮振動吸收峰；953.59 cm-1處的吸收峰為磷酸酯中磷氧單鍵的伸縮振動吸收峰。

2.4.3 電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）分析 目標雜質(zhì)正負離子模式下的m/z分別為：490.2[M+H]+，488.2[M-H]-。

2.4.4 核磁共振波譜（NMR）分析1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.14（s，9H），3.62（m，2H），4.02（m，3H；m，2H），4.32（m，2H），5.64（d，1H），5.79（s，1H），7.79（d，1H），顯示目標雜質(zhì)含7組（共計21個）非活潑氫，從低場到高場積分比例為1:1:1:2:5:2:9，見圖5。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：53.13，59.84，65.18，65.45，69.80，73.12，82.72，87.71，102.08，140.82，150.85，163.20，顯示目標雜質(zhì)含14組碳信號，化學位移53.13 ppm處碳原子因化學等同發(fā)生信號重疊，見圖6。HSQC譜圖顯示化學位移163.20 ppm和150.85 ppm處的碳原子與質(zhì)子無相互耦合作用，為2組季碳。31P NMR譜圖顯示目標雜質(zhì)含2組（共計2個）磷信號，從低場到高場積分比例為1:1，化學位移分別為-12.55，-12.68，-13.53，-13.66 ppm。

圖5 目標雜質(zhì)1H NMR圖譜

圖6 目標雜質(zhì)13C NMR圖譜

綜合以上波譜數(shù)據(jù)及胞磷膽堿鈉結(jié)構(gòu)，確定該目標雜質(zhì)為尿苷二磷酸膽堿（U D P C，C14H25N3O12P2），其結(jié)構(gòu)見圖7。

圖7 UDPC結(jié)構(gòu)

3 討論

此前，有人提出，由于胞磷膽堿鈉嘧啶環(huán)上的兩個氮的孤對電子都沒有共軛，在酸性條件下，氮與氫離子結(jié)合后有利于氨基離子（-NH3+）離去，水再作為親核試劑取代，最后異構(gòu)為雜質(zhì)UDPC[2]。實驗證明，堿性條件下，胞磷膽堿鈉也可降解為UDPC，其降解產(chǎn)生機制見圖8。

圖8 UDPC產(chǎn)生機制

該雜質(zhì)分離制備過程中，一次分離制備得到的目標雜質(zhì)色譜純度約92 %，二次分離制備后其色譜純度達98 %，樣品冷凍干燥后得到的固體粉末其色譜純度為96.34 %，色譜純度較冷凍干燥前有所降低，表明UDPC易降解，具有不穩(wěn)定性。另外，發(fā)現(xiàn)UDPC固體具有極強的吸濕性，凍干后所得固體顆粒極易吸潮融化，較難得到高純度的固體對照品。通過反復實驗，最終確定了該雜質(zhì)的分離制備方法及冷凍干燥程序，得到了色譜純度較高的固體對照品。該分離制備及冷凍干燥過程整體可控，可為分離制備具有相似性質(zhì)的該類雜質(zhì)對照品提供方法與思路。

近年，雜質(zhì)研究成為藥品研發(fā)的重要環(huán)節(jié)。為了更充分地研究藥品中的雜質(zhì)，需通過技術手段對藥品中的雜質(zhì)進行分離純化，以制得雜質(zhì)對照品，這通常需要花費大量的人力和物力。傳統(tǒng)的制備純化技術已不能滿足市場需求，需要成本更低、效率更高的替代技術。高壓制備型液相色譜系統(tǒng)（Prep-HPLC）是一種新型的制備色譜技術，同傳統(tǒng)低壓制備色譜方法相比較，應用該方法分離純化的產(chǎn)品在純度、回收率和分離效率等方面具有顯著優(yōu)勢，兼具泵流量大、進樣量大及分離時間短等優(yōu)點，因此在化學藥物和生物制品的研究及生產(chǎn)領域得到廣泛應用[3-10]。其中，動態(tài)軸向壓縮技術（dynamic axial compression，DAC）是工業(yè)色譜中最常用、最易實現(xiàn)、效果更為理想的高壓制備液相色譜技術。DAC系統(tǒng)因其柱效高，重復性好、分離效率高、制備量大等優(yōu)點而受到越來越多的關注[11]。