HPLC同時測定斑禿丸中11種活性組分

霍甜甜，李宜鮮

（河南省食品藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點實驗室，河南 鄭州 450009）

斑禿丸是由地黃、熟地黃、制何首烏、當歸、丹參、炒白芍、五味子、羌活、木瓜九味藥物組成，具有補益肝腎、養(yǎng)血生發(fā)的功效，收載于《中國藥典》2020年版一部。《中國藥典》[1]中僅規(guī)定了2, 3, 5, 4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）的定量測定方法，并在鑒別項下規(guī)定了當歸、丹參、炒白芍和制何首烏的薄層色譜（TLC）質(zhì)量控制方法，其余藥材未見涉及。但TLC不能準確定量，且實際操作過程較復雜，耗時長，受實驗環(huán)境影響較大。有文獻報道對該制劑白芍所含芍藥苷進行定量研究[2]；對熟地黃、地黃所含主要成分梓醇、麥角甾苷、吉奧諾苷B1、馬替諾皂苷，制何首烏所含主要成分二苯乙烯苷、大黃素甲醚，白芍所含指標性成分芍藥苷同時進行定量測定研究[3]。前者測定成分較單一，后者僅控制地黃、熟地黃、制何首烏和炒白芍的組分含量，涵蓋的藥物組分較少。

多指標成分測定能更好地從整體上控制中成藥的內(nèi)在質(zhì)量[4-10]，且盡量選取不同藥材中的組分進行測定，可更加全面地反應藥品質(zhì)量，以保證療效。在參考現(xiàn)有文獻的基礎(chǔ)上，本試驗選取地黃和熟地黃中的毛蕊花糖苷[11-12]，制何首烏中的二苯乙烯苷和大黃素[13]，當歸中的阿魏酸[14]，丹參中的丹參酮IIA和丹酚酸B[15]，炒白芍中芍藥苷[16]，五味子中的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素[17-18]，羌活中的異歐前胡素[19]作為斑禿丸的指標性成分。采用高效液相色譜（HPLC）梯度洗脫，首次建立了HPLC同時測定斑禿丸中的芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA和五味子乙素11種活性成分的測定方法，為更加全面地控制其內(nèi)在質(zhì)量提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司，2998二極管陣列檢測器）；XP105電子天平（瑞士 Mettler 公司）；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 （上海躍進）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（德國Millipore公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號：110736-201943，含量95.1 %），毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-201512，供含量測定用），阿魏酸對照品（批號：110773-201915，含量99.4 %），丹酚酸B對照品（批號：111562-201716，含量94.1 %），五味子醇甲對照品（批號：110857-200507，供含量測定用），大黃素對照品（批號：110756-201913，含量96.0 %），異歐前胡素對照品（批號：110827-201611，含量99.4 %），五味子甲素對照品（批號：0764-200005，供含量測定用），丹參酮IIA對照品（批號：110776-201721，含量99.5 %），五味子乙素對照品（批號：110765-200205，供含量測定用），均購自中國食品藥品檢定研究院；二苯乙烯苷對照品（批號：16081510，HPLC純度≥98 %，成都普菲德）；斑禿丸（廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每10丸重1 g，批號分別為B08030，B06026，B06019，B12053，B04013，B04008，B01005）；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agela Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，10 %A～15 %A；5～20 min，15 %A～55 %A；20～35 min，55 %A～75 %A；35～40 min，75 %A～80 %A；40～50 min，10 %A）；流量為1.0 ml/min；進樣量為10 μl；檢測波長為220 nm；柱溫為35 ℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA、五味子乙素的對照品適量，精密稱定，用50 %甲醇溶解，并配制成濃度分別為0.520，0.546，1.036，0.679，0.080，1.047，0.178，0.605，1.341，0.108，1.592 mg/ml的單標貯備液。再依次取上述各貯備液適量，置于同一10 ml量瓶中，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液（芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA、五味子乙素的濃度分別為51.982，21.840，103.600，6.789，47.878，20.940， 7.127，18.160，6.705，3.248，7.960 μg/ml），備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品30丸，研細混勻，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇25 ml，密塞，搖散藥粉，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用50 %甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按斑禿丸處方比例及工藝，分別制得缺地黃與熟地黃、制何首烏、當歸、丹參、炒白芍、五味子、羌活的陰性樣品，按2.2.2項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μl，按2.1項色譜條件進樣測定，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，各成分色譜峰之間的分離度均大于1.5；在與上述11種對照品色譜峰相應的保留時間處，陰性樣品溶液沒有對應的色譜峰，即陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 斑禿丸中11種活性組分含量測定的HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液1，2，5，10，15，20，25，30 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。以進樣量（X，ng）為橫坐標，相應峰面積（Y）為縱坐標，分別繪制各成分的標準曲線，結(jié)果見表1，可知各成分在各自進樣量范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表1 各成分線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗 取2.2.1項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣 6 次，記錄芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA和五味子乙素的峰面積，測得11個組分峰面積的RSD值依次為1.46 %，0.57 %，0.28 %，0.66 %，0.91 %，0.74 %，1.49 %，2.01 %，0.84 %，0.35 %，1.52 %，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取丸劑（批號：B08030），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于 0，4，8，12，18，24 h按2.1項下色譜條件進樣測定，測得芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮ⅡA和五味子乙素峰面積的RSD依次為1.08 %，1.69 %，1.02 %，0.84 %，0.57 %，0.75 %，1.52 %，0.76 %，0.68 %，0.89 %，1.33 %，表明供試品溶液在制備后室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批丸劑（批號：B08030），按2.2.2項下方法制備 6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，測得斑禿丸中芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA和五味子乙素的平均含量分別為1.790，0.397，2.364，0.146，3.942，0.642，0.198，0.487，0.111，0.116，0.188 mg/g，RSD依次為1.90 %，1.84 %，2.34 %，1.58 %，1.07 %，2.32 %，2.11 %，、0.86 %，1.36 %，1.44 %，2.47 %，表明本方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 取同一批各成分含有量已知的丸劑（批號：B08030），研細，分別取6份粉末，各約0.5 g，精密稱定，精密加入對照品溶液（含芍藥苷0.894 mg/ml、毛蕊花糖苷0.186 mg/ml、二苯乙烯苷1.173 mg/ml、阿魏酸0.074 mg/ml、丹酚酸B 2.088 mg/ml、五味子醇甲0.309 mg/ml、大黃素0.101 mg/ml、異歐前胡素0.240 mg/ml、五味子甲素0.052 mg/ml、丹參酮IIA 0.057 mg/ml、五味子乙素0.103 mg/ml）各1 ml，按 2.2.2項下方法制備加樣回收供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結(jié)果芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA和五味子乙素的平均回收率分別為97.64 %，102.61 %，96.95 %，98.23 %，95.64 %，99.53 %，97.90 %，99.02 %，103.55 %，102.31 %，100.24 %，RSD分別為1.54 %，2.75 %，1.11 %，1.78 %，2.24 %，1.45 %，3.04 %，2.70 %，1.87 %，2.88 %，2.47 %（n=6）。

2.4 樣品含量測定

分別取7批斑禿丸，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，外標法計算各成分含量，結(jié)果見表2。

表2 斑禿丸中11種成分的含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 梯度洗脫條件篩選

本試驗首先考察了流動相甲醇-水、乙腈-水[1]、乙腈-甲醇-水3種流動相系統(tǒng)對各成分的分離效果，結(jié)果乙腈-水系統(tǒng)對各成分的分離效果最好，各組分色譜峰間分離度均大于1.5；再考察了水、0.1 %磷酸溶液、0.2 %磷酸溶液和0.3 %磷酸溶液作為水相時對各色譜峰的影響，結(jié)果0.1 %～0.3 %磷酸溶液均能改善色譜峰的峰型，最終選擇乙腈-0.1 %磷酸溶液作為流動相。試驗過程中，嘗試通過增加流動相中乙腈的比例，使各成分均能更早出峰，且各峰分離度均大于1.5，但在專屬性試驗過程中發(fā)現(xiàn)，部分成分的色譜峰受未知峰的干擾較大，專屬性不強；嘗試將圖1所示20 min后的目標成分色譜峰出峰時間提前，結(jié)果7號和10號峰易受未知峰的干擾，無法達到基線分離。經(jīng)進一步研究，采用2.1項下梯度洗脫條件時，各目標峰峰型和分離度均良好，專屬性試驗無干擾，因此選擇該條件作為最終的色譜條件。

3.2 提取方法的選擇

按回流提取法提取供試品，考察了提取時間為20，40，60 min時的各成分提取率，結(jié)果當提取時間為60 min時，各成分的提取率均能達到97 %以上，因此確定最佳提取時間為60 min。考察了水浴回流提取和超聲兩種提取方法，結(jié)果表明當提取1 h時，水浴回流比超聲提取率高，因此采用回流提取法；考察以30 %甲醇、50 %甲醇、80 %甲醇和純甲醇作為提取溶劑時各成分的提取率，結(jié)果30 %甲醇提取的雜質(zhì)較多，綜合考慮各成分的提取率，選擇50 %甲醇作為提取溶劑。

3.3 檢測波長的選擇

由于11種組分的最大吸收波長各不相同，在試驗初期嘗試選擇不同的吸收波長分別測定各成分的含量，但使用不同波長對儀器的要求較高，普通的紫外檢測器無法達到要求或需要不斷切換波長。吸收波長在220 nm和各成分的最大吸收波長之間切換時，大多數(shù)組分峰面積變化不明顯，可滿足定量要求；影響較大的阿魏酸、二苯乙烯苷兩種組分，選擇220 nm和最大吸收波長分別定量測定，結(jié)果不同波長下測得的兩種組分含量差別不大，即均符合定量要求，最終選擇220 nm作為檢測波長。

綜上，本文建立HPLC法同時測定斑禿丸中11種活性組分含量的方法準確、簡便、快捷、實用性強，可為斑禿丸質(zhì)量標準的提升和完善，及臨床用藥提供可靠的質(zhì)量保證。