黃蜀葵花不同部位黃酮類成分含量的比較研究

郭小藤，劉 燕，張清華，尚立霞

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵[Abelmoschus manihot(L.) Medic.]的干燥花冠（帶雄蕊及花柱），作為藥用始于宋代，其后歷代本草均有記載，多用其花入藥[1]。內(nèi)服主治五淋，水腫，具有清利濕熱、消炎解毒之功效；外用治療癰疽腫毒，湯水燙傷[2]。近年對(duì)黃蜀葵花的研究主要集中于化學(xué)成分及藥理藥效研究。現(xiàn)代化學(xué)研究表明，黃蜀葵花的主要活性成分是黃酮類成分，其中以金絲桃苷、異槲皮苷含量最高，具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、保護(hù)心腦缺血損傷、改善肝腎功能、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管新生、抗病毒等多種藥理活性[3-4]。

黃蜀葵原產(chǎn)我國(guó)南方，喜溫暖濕潤(rùn)、雨量充沛、陽(yáng)光充足的氣候及排水良好、疏松肥沃的土壤，對(duì)生境要求不嚴(yán)，適應(yīng)性較強(qiáng)。目前除東北、西北等省外，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布或栽培[5]。黃蜀葵花藥材品質(zhì)參差不齊，市售藥材大多為全帶花托或全不帶花托的藥材，其中約有50 %為碎花。植物不同部位中有效成分含量通常存在差異。本研究比較了黃蜀葵花及其花瓣、花托、碎花中總黃酮、金絲桃苷、異槲皮苷的含量，旨在為黃蜀葵花的質(zhì)量評(píng)價(jià)及綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（2998PDA二極管陣列檢測(cè)器，Waters Empower工作站，均為美國(guó) Waters公司）；Agilent 8454 UV-Vis分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫）；Mettler XS-205電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；KQ 2200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：111521-201809，含量94.9 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；異槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)：111809-201804，含量，97.2 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；黃蜀葵花藥材[產(chǎn)地為江蘇，經(jīng)山東省藥學(xué)科學(xué)院泰山學(xué)者重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschus manihot(L.)Medic.的干燥花]；乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃蜀葵花不同部位樣品制備

本試驗(yàn)選用的藥材為江蘇種植的全帶花托和全無(wú)花托的樣品，詳見(jiàn)表1。

表1 黃蜀葵花藥材來(lái)源

每批藥材分別取樣200 g，從樣品中隨機(jī)選取100朵帶托花或不帶托花，分別稱重。將帶托花摘分為花托和花瓣（包括花蕊），分別稱重，從剩余樣品中篩選出長(zhǎng)度大于1.5 cm的花，剩余小于1.5 cm的為碎花，稱定碎花重量，計(jì)算不同部位占總重的比例，結(jié)果見(jiàn)表2，不同部位圖片見(jiàn)圖1。

表2 黃蜀葵花不同部位重量占比

圖1 黃蜀葵花藥材不同部位樣品

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備 取2.1項(xiàng)下不同批次不同部位的黃蜀葵花藥材樣品各約10 g，粉碎，過(guò)四號(hào)篩，分別取樣品粉末0.5 g，各2份，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含金絲桃苷80 μg的溶液，即得。

2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取對(duì)照品溶液3 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取供試品溶液1 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻。以50 %甲醇為空白，在200～800 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果金絲桃苷對(duì)照品與黃蜀葵花藥材供試品溶液在256 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，因此將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為256 nm，光譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 黃蜀葵花紫外-可見(jiàn)吸收光譜

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，分別置25 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻。以50 %甲醇為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法在256 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.0531C-0.0050（R2=0.99994），線性范圍為3.0596～18.3570 μg/ml。

2.2.5 樣品中總黃酮的含量測(cè)定 精密量取供試品溶液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，在256 nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中金絲桃苷的濃度，計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃蜀葵花不同部位總黃酮含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

黃蜀葵花全花樣品總黃酮含量為3.92 %～6.73 %，碎花樣品總黃酮含量為7.71 %～8.92 %，花瓣樣品總黃酮含量為5.72 %～7.12 %，花托樣品總黃酮含量為1.74 %～1.79 %。不同部位總黃酮含量的高低順序?yàn)樗榛ǎ净ò辏净ㄍ小?/p>

2.3 金絲桃苷、異槲皮苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1 %磷酸溶液（15:85），流速 1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm，進(jìn)樣量：10 μl，柱溫：35 ℃。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取金絲桃苷和異槲皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含金絲桃苷100 μg、異槲皮苷60 μg的混合溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取2.2.1項(xiàng)下黃蜀葵花藥材樣品粉末0.2 g，各2份，精密稱定，置25 ml量瓶中，加入甲醇15 ml超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖3。供試品溶液的色譜圖中，在與對(duì)照品溶液的色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，且金絲桃苷峰、異槲皮苷峰與相鄰峰之間的分離度均符合要求。

圖3 黃蜀葵花藥材HPLC圖譜

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取金絲桃苷對(duì)照品4.92 mg，異槲皮苷2.40 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液，精密量取貯備液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，1.5，2.0 ml，分別置5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性對(duì)照品溶液；分別精密吸取上述線性對(duì)照品溶液及貯備液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，分別以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，金絲桃苷、異槲皮苷濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。金絲桃苷、異槲皮苷的回歸方程分別為A=22 260.15C-43 397.18，A=21 460.69C-25 103.23；相關(guān)系數(shù)r分別為0.99997，0.99995。結(jié)果表明，金絲桃苷濃度在9.84～492.00 μg/ml、異槲皮苷濃度4.72～236.00 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取線性對(duì)照品溶液（含金絲桃苷98.40 μg/ml，異槲皮苷47.20 μg/ml），連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。計(jì)算金絲桃苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.21 %，0.35 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取線性對(duì)照品溶液（含金絲桃苷98.40 μg/ml，異槲皮苷47.20 μg/ml）及供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，18，24 h精密吸取各10 μl進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，對(duì)照品溶液中金絲桃苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.27 %，0.72 %（n=6），供試品溶液中金絲桃苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.32 %，0.64 %（n=6），表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取黃蜀葵花供試品粉末6份，每份0.2 g，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定供試品中金絲桃苷、異槲皮苷的含量。結(jié)果，金絲桃苷、異槲皮苷的平均含量分別為0.658 %，0.316 %，RSD分別為0.93 %，1.11 %（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的黃蜀葵花供試品粉末（金絲桃苷含量為0.658 %，異槲皮苷含量為0.316 %）62.4，78，93.6 mg，各3份，精密稱定，分別置于25 ml量瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液（含金絲桃苷0.502 mg/ml、異槲皮苷0.264 mg/ml）1.2，1.0，0.8 ml，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算各成分的加樣回收率及RSD。結(jié)果，金絲桃苷、異槲皮苷的平均回收率分別為98.89 %和100.95 %，RSD分別為0.91 %和0.96 %，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.3.10 樣品含量測(cè)定 分別取黃蜀葵花不同部位藥材粉末，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算金絲桃苷、異槲皮苷含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃蜀葵花不同部位金絲桃苷、異槲皮苷含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

黃蜀葵花全花樣品金絲桃苷含量為0.658 %～1.296 %，異槲皮苷含量為0.316 %～0.790 %；碎花樣品金絲桃苷含量為1.345 %～1.550 %，異槲皮苷含量為0.756 %～1.111 %；花瓣樣品金絲桃苷含量為1.018 %～1.370 %，異槲皮苷含量為0.537 %～0.688 %；花托樣品金絲桃苷含量為0.151 %～0.163 %，異槲皮苷含量為0.039 %～0.041 %。不同部位金絲桃苷、異槲皮苷含量的高低順序?yàn)樗榛ǎ净ò辏净ㄍ小?/p>

2.4 黃蜀葵花不同部位各成分含量的比較分析

采用SPSS 22.0分析軟件對(duì)黃蜀葵花不同部位的各成分含量進(jìn)行方差分析和LSD多重比較，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表5 黃蜀葵花不同部位各成分含量方差分析結(jié)果

表6 黃蜀葵花不同部位各成分含量多重比較結(jié)果

表6（續(xù)）

方差分析結(jié)果顯示，P＜0.05，說(shuō)明黃蜀葵花不同部位中相應(yīng)成分的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)LSD多重比較可知，全帶托的黃蜀葵花、碎花、花瓣中相應(yīng)成分的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，全無(wú)托的黃蜀葵花、碎花、花瓣兩兩之間總黃酮的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，全無(wú)托的碎花與花瓣中金絲桃苷的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，全無(wú)托的碎花與全花、碎花與花瓣中異槲皮苷的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

近年，關(guān)于黃蜀葵花中黃酮類化合物的研究較多，但黃蜀葵花不同部位黃酮類化合物的含量比較尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)比較了黃蜀葵花、花瓣、花托、碎花中的黃酮類成分含量，采用SPSS軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示：①黃蜀葵花不同部位均含總黃酮、金絲桃苷和異槲皮苷，各成分在不同部位的含量分布不同，碎花＞花瓣＞花托，不同部位間各成分含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②花托重量占全花重量比例約為42 %，但其有效成分含量較低，金絲桃苷含量約為全花的20 %，異槲皮苷約為11 %。按中國(guó)藥典規(guī)定，黃蜀葵花藥材應(yīng)為錦葵科植物黃蜀葵的干燥花冠[6]，而市售藥材多為帶花托的整花，與藥典中的藥用部位不一致。增加的花托部分降低了藥材的質(zhì)量，在藥品研發(fā)及生產(chǎn)時(shí)需手工將花托摘去，操作無(wú)法實(shí)現(xiàn)規(guī)范統(tǒng)一，同時(shí)也增加了前處理工序和生產(chǎn)成本，不利于黃蜀葵花藥材的開發(fā)利用。③碎花的各成分含量均較高，分析原因?yàn)樗榛ㄝp薄，相同重量下純花瓣數(shù)量更多。由于全無(wú)托的花經(jīng)干燥后易分散，如果經(jīng)過(guò)反復(fù)分裝、運(yùn)輸易破碎并產(chǎn)生較多碎花，且在市場(chǎng)流通環(huán)節(jié)中，碎花極易損失，致使藥材中含量較高的部位流失，影響黃蜀葵花藥材的療效。

由結(jié)果可見(jiàn)，黃蜀葵花在種植、采收、加工、貯藏及運(yùn)輸過(guò)程均會(huì)使不同批次藥材的外觀性狀產(chǎn)生較大差異，從而影響黃蜀葵花有效成分的含量。隨著市場(chǎng)對(duì)黃蜀葵花藥材需求的逐年增加，全國(guó)各地建立了多處種植基地，種植面積及產(chǎn)量也逐年增加，本研究結(jié)果表明，需對(duì)藥材的整個(gè)生產(chǎn)加工過(guò)程進(jìn)行更規(guī)范化、嚴(yán)格化的管理，如在采摘時(shí)注意去掉含量較低的花托；再如碎花中的各成分含量均較高，在干燥過(guò)程中需嚴(yán)格控制藥材厚度、干燥時(shí)間、干燥溫度等參數(shù)，按中國(guó)藥典控制藥材水分低于12 %的同時(shí)，盡可能避免過(guò)度干燥，以減少碎花的破碎，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)分裝，減少在包裝運(yùn)輸過(guò)程中碎花的產(chǎn)生，以保證藥材的質(zhì)量。

本研究采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定黃蜀葵花中總黃酮含量[7]，采用HPLC同時(shí)測(cè)定金絲桃苷和異槲皮苷的含量[6]，方法準(zhǔn)確度、靈敏度高，重現(xiàn)性好，所得數(shù)據(jù)可靠。本研究不僅對(duì)黃蜀葵花藥材不同部位的總黃酮量進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)對(duì)總黃酮中含量及活性最高的指標(biāo)成分金絲桃苷、異槲皮苷進(jìn)行了定量分析，揭示了黃蜀葵花藥材中總黃酮與單成分含量之間的關(guān)系，更全面地評(píng)價(jià)了黃蜀葵花藥材的質(zhì)量，可為進(jìn)一步研究有效部位與單成分之間的相關(guān)性和藥效機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。