黃蜀葵花不同部位黃酮類成分含量的比較研究

郭小藤，劉 燕，張清華，尚立霞

（山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵[Abelmoschus manihot(L.) Medic.]的干燥花冠（帶雄蕊及花柱），作為藥用始于宋代，其后歷代本草均有記載，多用其花入藥[1]。內服主治五淋，水腫，具有清利濕熱、消炎解毒之功效；外用治療癰疽腫毒，湯水燙傷[2]。近年對黃蜀葵花的研究主要集中于化學成分及藥理藥效研究。現代化學研究表明，黃蜀葵花的主要活性成分是黃酮類成分，其中以金絲桃苷、異槲皮苷含量最高，具有抗炎、解熱鎮痛、保護心腦缺血損傷、改善肝腎功能、抑制腫瘤細胞增殖、促進血管新生、抗病毒等多種藥理活性[3-4]。

黃蜀葵原產我國南方，喜溫暖濕潤、雨量充沛、陽光充足的氣候及排水良好、疏松肥沃的土壤，對生境要求不嚴，適應性較強。目前除東北、西北等省外，全國大部分地區均有分布或栽培[5]。黃蜀葵花藥材品質參差不齊，市售藥材大多為全帶花托或全不帶花托的藥材，其中約有50 %為碎花。植物不同部位中有效成分含量通常存在差異。本研究比較了黃蜀葵花及其花瓣、花托、碎花中總黃酮、金絲桃苷、異槲皮苷的含量，旨在為黃蜀葵花的質量評價及綜合開發利用提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（2998PDA二極管陣列檢測器，Waters Empower工作站，均為美國 Waters公司）；Agilent 8454 UV-Vis分光光度計（美國安捷倫）；Mettler XS-205電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；KQ 2200DA型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

金絲桃苷對照品（批號：111521-201809，含量94.9 %，中國食品藥品檢定研究院）；異槲皮苷對照品（批號：111809-201804，含量，97.2 %，中國食品藥品檢定研究院）；黃蜀葵花藥材[產地為江蘇，經山東省藥學科學院泰山學者重點實驗室鑒定為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschus manihot(L.)Medic.的干燥花]；乙腈為色譜純，磷酸為優級純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 黃蜀葵花不同部位樣品制備

本試驗選用的藥材為江蘇種植的全帶花托和全無花托的樣品，詳見表1。

表1 黃蜀葵花藥材來源

每批藥材分別取樣200 g，從樣品中隨機選取100朵帶托花或不帶托花，分別稱重。將帶托花摘分為花托和花瓣（包括花蕊），分別稱重，從剩余樣品中篩選出長度大于1.5 cm的花，剩余小于1.5 cm的為碎花，稱定碎花重量，計算不同部位占總重的比例，結果見表2，不同部位圖片見圖1。

表2 黃蜀葵花不同部位重量占比

圖1 黃蜀葵花藥材不同部位樣品

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 取2.1項下不同批次不同部位的黃蜀葵花藥材樣品各約10 g，粉碎，過四號篩，分別取樣品粉末0.5 g，各2份，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，備用。

2.2.2 對照品溶液的制備 取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含金絲桃苷80 μg的溶液，即得。

2.2.3 測定波長的選擇 精密量取對照品溶液3 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取供試品溶液1 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻。以50 %甲醇為空白，在200～800 nm范圍內掃描，結果金絲桃苷對照品與黃蜀葵花藥材供試品溶液在256 nm波長處均有最大吸收，因此將檢測波長確定為256 nm，光譜圖見圖2。

圖2 黃蜀葵花紫外-可見吸收光譜

2.2.4 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，分別置25 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻。以50 %甲醇為空白，照紫外-可見分光光度法在256 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：A=0.0531C-0.0050（R2=0.99994），線性范圍為3.0596～18.3570 μg/ml。

2.2.5 樣品中總黃酮的含量測定 精密量取供試品溶液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，在256 nm處測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中金絲桃苷的濃度，計算總黃酮含量。結果見表3。

表3 黃蜀葵花不同部位總黃酮含量測定結果（n=2）

黃蜀葵花全花樣品總黃酮含量為3.92 %～6.73 %，碎花樣品總黃酮含量為7.71 %～8.92 %，花瓣樣品總黃酮含量為5.72 %～7.12 %，花托樣品總黃酮含量為1.74 %～1.79 %。不同部位總黃酮含量的高低順序為碎花＞花瓣＞花托。

2.3 金絲桃苷、異槲皮苷含量測定

2.3.1 色譜條件 Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1 %磷酸溶液（15:85），流速 1.0 ml/min，檢測波長：360 nm，進樣量：10 μl，柱溫：35 ℃。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 取金絲桃苷和異槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含金絲桃苷100 μg、異槲皮苷60 μg的混合溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取2.2.1項下黃蜀葵花藥材樣品粉末0.2 g，各2份，精密稱定，置25 ml量瓶中，加入甲醇15 ml超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.4 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖3。供試品溶液的色譜圖中，在與對照品溶液的色譜圖相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，且金絲桃苷峰、異槲皮苷峰與相鄰峰之間的分離度均符合要求。

圖3 黃蜀葵花藥材HPLC圖譜

2.3.5 線性關系考察 精密稱取金絲桃苷對照品4.92 mg，異槲皮苷2.40 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，精密量取貯備液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，1.5，2.0 ml，分別置5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性對照品溶液；分別精密吸取上述線性對照品溶液及貯備液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，分別以峰面積（A）為縱坐標，金絲桃苷、異槲皮苷濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。金絲桃苷、異槲皮苷的回歸方程分別為A=22 260.15C-43 397.18，A=21 460.69C-25 103.23；相關系數r分別為0.99997，0.99995。結果表明，金絲桃苷濃度在9.84～492.00 μg/ml、異槲皮苷濃度4.72～236.00 μg/ml范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.3.6 精密度試驗 取線性對照品溶液（含金絲桃苷98.40 μg/ml，異槲皮苷47.20 μg/ml），連續進樣6次，記錄峰面積。計算金絲桃苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.21 %，0.35 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 溶液穩定性試驗 取線性對照品溶液（含金絲桃苷98.40 μg/ml，異槲皮苷47.20 μg/ml）及供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，18，24 h精密吸取各10 μl進樣測定，記錄峰面積。結果，對照品溶液中金絲桃苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.27 %，0.72 %（n=6），供試品溶液中金絲桃苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.32 %，0.64 %（n=6），表明對照品溶液和供試品溶液在24 h內均穩定。

2.3.8 重復性試驗 精密稱取黃蜀葵花供試品粉末6份，每份0.2 g，按2.3.3項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件測定供試品中金絲桃苷、異槲皮苷的含量。結果，金絲桃苷、異槲皮苷的平均含量分別為0.658 %，0.316 %，RSD分別為0.93 %，1.11 %（n=6），表明該方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收試驗 取已知含量的黃蜀葵花供試品粉末（金絲桃苷含量為0.658 %，異槲皮苷含量為0.316 %）62.4，78，93.6 mg，各3份，精密稱定，分別置于25 ml量瓶中，分別精密加入對照品溶液（含金絲桃苷0.502 mg/ml、異槲皮苷0.264 mg/ml）1.2，1.0，0.8 ml，按2.3.3項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件測定峰面積，計算各成分的加樣回收率及RSD。結果，金絲桃苷、異槲皮苷的平均回收率分別為98.89 %和100.95 %，RSD分別為0.91 %和0.96 %，表明該方法準確度較好。

2.3.10 樣品含量測定 分別取黃蜀葵花不同部位藥材粉末，按2.3.3項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件測定，按外標法以峰面積計算金絲桃苷、異槲皮苷含量。結果見表4。

表4 黃蜀葵花不同部位金絲桃苷、異槲皮苷含量測定結果（n=2）

黃蜀葵花全花樣品金絲桃苷含量為0.658 %～1.296 %，異槲皮苷含量為0.316 %～0.790 %；碎花樣品金絲桃苷含量為1.345 %～1.550 %，異槲皮苷含量為0.756 %～1.111 %；花瓣樣品金絲桃苷含量為1.018 %～1.370 %，異槲皮苷含量為0.537 %～0.688 %；花托樣品金絲桃苷含量為0.151 %～0.163 %，異槲皮苷含量為0.039 %～0.041 %。不同部位金絲桃苷、異槲皮苷含量的高低順序為碎花＞花瓣＞花托。

2.4 黃蜀葵花不同部位各成分含量的比較分析

采用SPSS 22.0分析軟件對黃蜀葵花不同部位的各成分含量進行方差分析和LSD多重比較，結果見表5、表6。

表5 黃蜀葵花不同部位各成分含量方差分析結果

表6 黃蜀葵花不同部位各成分含量多重比較結果

表6（續）

方差分析結果顯示，P＜0.05，說明黃蜀葵花不同部位中相應成分的含量差異有統計學意義。通過LSD多重比較可知，全帶托的黃蜀葵花、碎花、花瓣中相應成分的含量差異有統計學意義，全無托的黃蜀葵花、碎花、花瓣兩兩之間總黃酮的含量差異有統計學意義，全無托的碎花與花瓣中金絲桃苷的含量差異有統計學意義，全無托的碎花與全花、碎花與花瓣中異槲皮苷的含量差異有統計學意義。

3 討論

近年，關于黃蜀葵花中黃酮類化合物的研究較多，但黃蜀葵花不同部位黃酮類化合物的含量比較尚未見報道。本試驗比較了黃蜀葵花、花瓣、花托、碎花中的黃酮類成分含量，采用SPSS軟件對測定結果進行方差分析，結果顯示：①黃蜀葵花不同部位均含總黃酮、金絲桃苷和異槲皮苷，各成分在不同部位的含量分布不同，碎花＞花瓣＞花托，不同部位間各成分含量差異有統計學意義（P＜0.05）。②花托重量占全花重量比例約為42 %，但其有效成分含量較低，金絲桃苷含量約為全花的20 %，異槲皮苷約為11 %。按中國藥典規定，黃蜀葵花藥材應為錦葵科植物黃蜀葵的干燥花冠[6]，而市售藥材多為帶花托的整花，與藥典中的藥用部位不一致。增加的花托部分降低了藥材的質量，在藥品研發及生產時需手工將花托摘去，操作無法實現規范統一，同時也增加了前處理工序和生產成本，不利于黃蜀葵花藥材的開發利用。③碎花的各成分含量均較高，分析原因為碎花輕薄，相同重量下純花瓣數量更多。由于全無托的花經干燥后易分散，如果經過反復分裝、運輸易破碎并產生較多碎花，且在市場流通環節中，碎花極易損失，致使藥材中含量較高的部位流失，影響黃蜀葵花藥材的療效。

由結果可見，黃蜀葵花在種植、采收、加工、貯藏及運輸過程均會使不同批次藥材的外觀性狀產生較大差異，從而影響黃蜀葵花有效成分的含量。隨著市場對黃蜀葵花藥材需求的逐年增加，全國各地建立了多處種植基地，種植面積及產量也逐年增加，本研究結果表明，需對藥材的整個生產加工過程進行更規范化、嚴格化的管理，如在采摘時注意去掉含量較低的花托；再如碎花中的各成分含量均較高，在干燥過程中需嚴格控制藥材厚度、干燥時間、干燥溫度等參數，按中國藥典控制藥材水分低于12 %的同時，盡可能避免過度干燥，以減少碎花的破碎，同時應避免反復分裝，減少在包裝運輸過程中碎花的產生，以保證藥材的質量。

本研究采用紫外可見分光光度法測定黃蜀葵花中總黃酮含量[7]，采用HPLC同時測定金絲桃苷和異槲皮苷的含量[6]，方法準確度、靈敏度高，重現性好，所得數據可靠。本研究不僅對黃蜀葵花藥材不同部位的總黃酮量進行了測定，同時對總黃酮中含量及活性最高的指標成分金絲桃苷、異槲皮苷進行了定量分析，揭示了黃蜀葵花藥材中總黃酮與單成分含量之間的關系，更全面地評價了黃蜀葵花藥材的質量，可為進一步研究有效部位與單成分之間的相關性和藥效機制提供數據支持。