食品中米酵菌酸和毒黃素一測多評方法的探討

葉文芳，陳嘉聰，王曉琴，張豐蕓，黃秀麗，朱文娟，趙智鋒

（惠州市食品藥品檢驗所，廣東 惠州 516000）

近年，由椰毒假單胞菌酵米面亞種（Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans，簡稱椰酵假單胞菌）引起的食物中毒事件時有發生。據文獻報道，椰酵假單胞菌在適宜的條件下會產生米酵菌酸（bongkrekic acid）和毒黃素（toxoflavin）[1-3]。其中，米酵菌酸毒性強于毒黃素，是主要致死因子。毒黃素毒性雖弱于米酵菌酸，但毒黃素會造成組織與細胞損傷，同時毒黃素還具有致突變作用和潛在的致癌性[4-6]。

一測多評法（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）是利用易得、廉價、有效的化學物為代表性成分，借助待測物中有效成分的內在函數和比例關系，以一個標準品為參照物，建立該成分與其他成分間的相對校正因子，并通過其計算含量，使其計算值與實測值符合定量方法學的要求，實現多組分的同時測定[7]。本研究選取米酵菌酸為內參物，考察米酵菌酸與毒黃素之間的相對校正因子，探討QAMS用于毒黃素含量測定的可行性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，配DAD 檢測器（日本島津公司）；Agilent 1200 高效液相色譜儀，配DAD 檢測器（美國安捷倫公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀，配DAD 檢測器（美國安捷倫公司）；Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀（廈門睿科）。

1.2 材料

米酵菌酸（純度≥95 %，上海安譜）；毒黃素（純度≥98 %，上海甄準）；增強型脂質去除凈化管（QuEChERS dSPE EMR-Lipid，廣州安捷倫）；除脂萃取鹽包（Polish Tube-NaCl/MgSO4，廣州安捷倫科）；固相萃取凈化管（dSPE Cleaneup Tubes，成分配比：MgSO4300 mg，PSA 100 mg，C18100 mg，容量15 ml，上海安譜）；Cleanert?MAS-Q系列酸性物質凈化固相萃取柱（成分配比：PSA 400 mg，C18400 mg，MgSO41.2 g，容量15 ml，天津博納艾杰爾）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；實驗用水為超純水；分析樣品濕米粉、銀耳、黑木耳、玉米面均為本實驗室日常抽檢的樣品。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（柱長250 mm，內徑4.6 mm，粒度5 μm）；流動相：甲醇（A）和水（B），水用甲酸調pH 3.0；流速：1 ml/min；檢測波長：258 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl，梯度洗脫程序見表1。

表1 毒黃素和米酵菌酸的測定梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液配制

準確稱取米酵菌酸對照品10 mg，加甲醇溶解，轉移至100 ml量瓶中，加甲醇定容；準確稱取毒黃素對照品10 mg，加甲醇溶解，轉移至100 ml量瓶中，加甲醇定容。準確吸取上述溶液各25 ml，置于同一50 ml量瓶中，配制成50 μg/ml的混合對照品儲備液。分別取混合對照品儲備液適量，配制成毒黃素、米酵菌酸濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 μg/ml的系列混合對照品溶液。

2.3 樣品前處理

取粉碎混勻的試樣約2 g，精密稱定，于50 ml塑料離心管中，加入甲醇-水（8:2，v/v）10 ml，渦旋2 min，超聲10 min，5000 r/min離心5 min，吸取上清至預裝dSPE EMR-Lipid吸附劑的離心管中，渦旋2 min，5000 r/min離心5 min，然后取上清于氮吹管中；重復上述提取、凈化步驟，合并上清后于40 ℃水浴中氮吹至低于1 ml，用甲醇定容至1 ml，0.22 μm濾膜過濾后進行分析。

3 結果與分析

3.1 提取方法及色譜條件的優化

以濕米粉為基質，考察不同提取溶劑（甲醇、乙腈、80 %甲醇、80 %乙腈），提取次數，流動相pH值（pH 2.5，pH 3.0，pH 3.5）及其酸度調節劑（甲酸、乙酸、磷酸），以及檢測波長對毒黃素及米酵菌回收率的影響。結果表明，以80 %甲醇為提取溶劑，提取2次，以甲酸作為流動相B的酸度調節劑，流動相B pH 3.0及檢測波長258 nm時，毒黃素和米酵菌酸的回收率均最優。

3.2 方法學考察

3.2.1 線性關系、方法檢出限及定量限 分別精密吸取2.2項下系列濃度的混合對照品溶液各10 μl，按2.1項下色譜條件進樣分析。以峰面積為縱坐標，米酵菌酸和毒黃素濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。結果表明，米酵菌酸和毒黃素在0.5～25 μg/ml范圍內呈良好的線性關系，相關系數分別為0.99999和0.99991。線性關系、方法檢出限及定量限見表2。

表2 米酵菌酸和毒黃素的線性關系、方法檢出限及定量限

3.2.2 穩定性試驗 取濕米粉樣品，按2.3項方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0，6，12，18，24，30，36 h進樣10 μl，測定，測得18 h內毒黃素峰面積RSD為4.79 %，而后峰面積明顯衰減，24，30，36 h的RSD分別為6.13 %，7.46 %，8.95 %，RSD均大于5 %；36 h內米酵菌酸峰面積RSD為0.83 %，穩定性較好。

3.2.3 方法回收率與精密度 選取銀耳、黑木耳、玉米面及濕米粉4種不同基質，進行3水平的加標回收試驗和精密度試驗, 每種基質的每個水平進行6次平行測定，結果見表3。在2，8，16 μg/ml 3個加標水平下，毒黃素的平均回收率為88.94 %，RSD為1.50 %；米酵菌酸的平均回收率為90.43 %，RSD為1.43 %。結果表明方法的準確度和精密度良好。

表3 毒黃素和米酵菌酸的回收率結果（n=6）

4 相對校正因子的建立及其適用性評價

4.1 相對校正因子（f）的建立

精密吸取2.2.4項下混合對照品工作溶液，分別取1，2，5，10，15，20 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以米酵菌酸為內參物，按下式計算QAMSf值，結果見表4。

表4 f值測定結果

式中Ci為內標物濃度，Ai為內標物峰面積，Cs為組分s濃度，As為組分s峰面積）[7-8]。

4.2 相對保留時間（RT）的確定

RT指各待測成分與內參物間保留時間的比值。結果表明待測組分間的RT值波動較小（RSD＜5 %），因此在缺乏對照品的情況下，利用RT值，并根據內參物的保留時間，結合色譜峰的紫外吸收特征，能比較準確合理地確定目標成分的位置。結果見表5。

表5 RT值的測定結果

4.3 系統適用性考察

4.3.1 色譜柱對f的影響 采用Agilent 1260高效液相色譜儀，分別考察3種不同品牌的色譜柱對f值的影響，結果見表6。由表6可見，毒黃素與內參物米酵菌酸f值重現性較差（RSD＞5 %）。

表6 不同色譜柱對相對校正因子的影響

4.3.2 儀器對f的影響 采用Uitimate?UHPLC AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分別考察3種不同高效液相色譜儀對f的影響結果，結果見表7。由表7可見，毒黃素與內參物米酵菌酸f重現性較差（RSD＞5 %）。

表7 不同儀器對f值的影響

4.3.3 流速、柱溫、波長對f的影響 采用Agilent 1260高效液相色譜儀和Uitimate?UHPLC AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分別考察3種不同流速（0.9，1.0，1.1 ml/min）、不同柱溫（25，30，35 ℃）及不同波長微小變化（波長分別為255，258，260 nm）對f的影響，結果見表8。由表8可見，這3個條件對毒黃素與內參物米酵菌酸f影響較小，重現性良好（RSD＜5 %）。

表8 不同色譜條件對f值的影響

4.4 QAMS待測色譜峰的定位

試驗中分別考察了米酵菌酸和毒黃素2種成分間RT值在3個不同型號的高效液相色譜儀和3種不同品牌色譜柱中的重現性，見表9。結果顯示，RT值變化較大（RSD＞5 %），重現性較差。

表9 待測色譜峰的RT值

5 討論

本試驗以濕米粉為例，通過方法學驗證、方法的耐用性、系統適用性考察，探討應用QAMS檢測椰毒假單胞菌酵米面亞種兩種代謝產物毒黃素和米酵菌酸的可行性。試驗中對不同液相色譜儀、不同色譜柱、不同流速、不同柱溫和不同波長對f的影響進行考察。其中不同液相色譜儀與不同色譜柱使f變化大，重現性差，RT值不穩定。結果表明，QAMS在實際應用中存在一定的局限性，不適用于毒黃素與米酵菌酸的測定。其原因可能有以下幾點。

5.1 化合物類型（母核）不同

據相關研究，QAMS應用于同類型化合物（母核相同、僅僅是取代基的差異）的同時測定是完全沒有問題的，而對于不同類型的化合物，現有研究結果尚無法得出確定性的結論[9]。不同類型化合物的基本母核不一樣，導致其紫外吸收不同。米酵菌酸是一種脂溶性酸性化合物，分子式 C28H38O7，相對分子質量486.61, 化學名為3-羧甲基-17-甲氧基-6, 8, 21-三甲基二十二碳-2, 4, 8, 12, 14, 18, 20-七烯二酸[10]，結構見圖1。毒黃素為水溶性黃色素，分子式為 C7H7N5O2，相對分子質量193.21 ，化學名1, 6-二甲基-5, 7-二氧-1, 5, 6, 7-四氫嘧啶基（5,4e）非對稱三嗪，結構見圖2。二者基本母核不同。

圖1 米酵菌酸結構

圖2 毒黃素結構

研究報道表明，QAMS多應用于中藥成分含量研究，食品領域研究報道較少，且多集中在保健食品方面[9]。QAMS應用于同類型化合物的測定被證實是完全可行的，但對于不同類型的化合物，尚有待進一步的研究，其應用具有一定的局限性[11]。

據分析，目前報道的QAMS法，主要針對紫外共軛吸收強的多酚類化合物，使用HPLC/UV或UPLC/UV進行測定，但在食品中還有大量紫外吸收弱、甚至無吸收的化合物[9]。本試驗中雖然毒黃素分子結構中含若干共軛鍵，但米酵菌酸分子多是單鍵連接，紫外吸收較弱，無法與毒黃素在紫外吸收峰面積上構成正比關系，進而導致其f值的不穩定，在不同系統中存在較大差異。

本研究對GB 5009.189-2016[12]條件進行優化，所建方法可有效解決樣品中雜質干擾的問題，并可實現毒黃素和米酵菌酸的有效分離。在此基礎上建立食品中毒黃素和米酵菌酸的QAMS測定方法，但在更換液相色譜儀條件下，f值及RT值重現性較差，難以實現以米酵菌酸為參照物，對食品中毒黃素含量進行同時測定。更優化的方法有待進一步研究探討。