基于HPLC和多元統計分析的清熱解毒口服液質量評價模式研究

朱偉堃，井改革，趙蕊蕊，王素香，趙丹彤

（1. 菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000；2. 山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355）

清熱解毒口服液屬清熱解毒類中成藥，收載于《中國藥典》2020年版一部，由石膏、金銀花、玄參、地黃、黃芩、梔子、連翹等十二味中藥組成[1]。具清熱解毒之功效，用于熱毒壅盛所致的發熱面赤、煩躁口渴、咽喉腫痛；流感、上呼吸道感染見上述證候者。清熱解毒口服液生產廠家眾多，據統計，目前全國有211家生產企業。

清熱解毒口服液成分較多，單一指標難以對其進行質量控制，故本文選取了清熱解毒口服液中主要起抑菌[2]、清熱解毒[3-5]作用的4種成分綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷為指標進行測定和分析。目前，對于4種成分的含量測定雖有報道[6-9]，但均未進行系統的信息處理分析，無法綜合系統地評價各生產企業樣品的質量。因此，本文采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定清熱解毒口服液4種成分含量的方法，并采用雷達圖分析，結合聚類分析和主成分分析對11家企業的37批次樣品進行評價和分類，為清熱解毒口服液的質量評價提供了思路和科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 II高效液相色譜儀（安捷倫）；XS105型十萬分之一電子天平（Mettler Toledo）；超純水儀（默克密理博）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號：110753-202018，含量：96.1 %），梔子苷對照品（批號：110749-201919，含量：97.1 %），連翹苷對照品（批號：110821-201816，含量：95.1 %），黃芩苷對照品（批號：110715-201821，含量95.4 %，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，默克公司），磷酸（色譜純，國藥集團）；清熱解毒口服液樣品來自2020年山東省內市場流通抽樣，具體樣品收集情況見表1。

表1 樣品收集情況

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30 ℃。以甲醇（A）-0.1 %磷酸（B）為流動相，梯度洗脫（0～20 min，10 %A→25 %A，90 %B→75 %B；20～40 min，25 %A→50 %A，75 %B→50 %B；40～55 min，50 %A，50 %B；55～60 min，50 %A→10 %A，50 %B→90 %B；60～70 min，10 %A，90 %B）。流速1.0 ml/min，進樣量：10 μl。檢測波長326 nm（0～25 min，測定綠原酸），238 nm（25～35 min，測定梔子苷），230 nm（35～45 min，測定連翹苷），276 nm（45～70 min，測定黃芩苷）。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷對照品10.88，10.42，10.38，12.15 mg，分別置25，25，25，50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。分別精密量取上述對照品貯備溶液1.00，1.00，1.00，4.00 ml，置同一10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得分別含綠原酸41.82 μg/ml、梔子苷40.47 μg/ml、連翹苷39.49 μg/ml、黃芩苷92.73 μg/ml的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品1.00 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 專屬性考察

2.4.1 陰性樣品溶液的制備 按工藝方法制備缺少金銀花、梔子、連翹和黃芩的陰性樣品，并按2.3項下方法，制得陰性樣品溶液。

2.4.2 專屬性試驗 分別精密吸取2.2項下的混合對照品溶液，2.4.1項下的缺金銀花、梔子、連翹和黃芩的陰性樣品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，結果見圖1。陰性樣品圖譜中，未呈現與綠原酸、梔子苷、連翹苷和黃芩苷保留時間相同的色譜峰，表明制劑中處方的其他藥味及輔料對檢測結果無干擾，該方法專屬性良好。

圖1 專屬性色譜圖

2.5 線性關系考察

分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液3，5，10，12，15 μl，依次注入高效液相色譜儀，按2.1項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。分別以綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷的進樣量（μg）為橫坐標，各峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表2。結果表明，4種成分在一定范圍內均有較好的線性關系。

表2 各成分的標準曲線方程、相關系數、線性范圍及檢測限、定量限

2.6 檢測限和定量限

將2.2項下的混合對照品溶液逐級稀釋，以信噪比（S/N）為10時的相應濃度為定量限，各成分定量限見表2；以信噪比（S/N）為3時的相應濃度為檢測限，各成分檢測限見表2。

2.7 精密度試驗

分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液10 μl，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，結果綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.23 %，0.27 %，0.53 %，0.59 %，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μl，室溫下放置，按2.1項下色譜條件，分別在0，2，8，12，24 h進樣測定，測得供試品溶液中綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷4個成分峰面積的RSD分別為0.34 %，0.26 %，1.33 %，0.13 %，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.9 重復性試驗

取同一批清熱解毒口服液樣品（批號：20200306），平行量取6份，每份分別精密量取1.00 ml，按2.3項下方法制得供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，并計算待測成分的含量。結果綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷的含量平均值分別為0.559，1.595，0.204，2.436 mg/ml，RSD依次為0.29 %，0.31 %，1.85 %，0.22 %，表明本方法重復性良好。

2.10 加樣回收試驗

取2.8項下已知待測成分含量的清熱解毒口服液（批號：20200306）0.50 ml，共6份，分別置25 ml量瓶中，分別依次精密加入2.2項下綠原酸、梔子苷、連翹苷和黃芩苷對照品貯備溶液0.50，2.00，0.30，5.00 ml。按2.3項下方法操作，制備加樣回收樣品溶液。按2.1項下色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果

2.11 樣品測定

精密量取各生產企業的清熱解毒口服液1.00 ml，按2.3項下方法制得供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，依照2.6項下回歸方程計算各成分的含量，含量分布直方圖見圖2。由圖2可見，各成分含量跨度較大，且4種成分的含量分布趨勢均有所不同。同時，按《中國藥典》2020年版一部含量測定項下黃芩苷的含量測定方法，測定了37批次樣品中黃芩苷的含量。并將新建立的方法和藥典方法測得的黃芩苷含量，用SPSS Statistics 19.0進行了統計分析，結果P=0.379＞0.05，說明兩種方法的測定結果差異無統計學意義，進一步說明建立的方法準確、可行。

圖2 樣品含量頻率分布直方圖

2.12 多元統計分析

為進一步綜合系統分析清熱解毒口服液的質量，本研究分別采用雷達圖分析、聚類圖分析和主成分分析對11家企業共37批次樣品進行分析。

2.12.1 雷達圖分析 以綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷含量為質量評價因子，采用Excel 2003版軟件繪制37批次清熱解毒口服液樣品的雷達圖，通過比較其輪廓大小及各成分分布情況來反映不同企業樣品的質量差異[10]，結果見圖3。結果顯示，B、H、J、N、P企業樣品中4種成分的輪廓較大且分布平衡度較好，提示其樣品質量較好；E、G、I、K、O企業樣品中4種成分分布平衡度較差；A企業樣品中4種成分的輪廓較小，提示樣品質量有所欠缺。

圖3 雷達分析圖

2.12.2 聚類分析 以綠原酸、梔子苷、連翹苷、黃芩苷4種成分的含量為變量，采用SPSS Statistics 19.0軟件，選用組間連接法，以Euclidean距離平方為測度，對37批清熱解毒口服液樣品進行聚類分析，聚類結果見圖4。企業聚類結果顯示，樣品聚為兩大類，J、H、B、P、N企業為一類，I、G、E、O、K、A企業為一類。觀察各批次樣品4種成分含量可發現，J、H、B、P、N企業樣品4種成分含量普遍較高，說明整體質量相對較好。

圖4 聚類分析樹狀圖

以上述提取的1個主成分因子變量繪制得分圖，見圖5。11家企業的37批次樣品可歸為兩組，其中I、G、E、O、K、A企業為一組，J、H、B、P、N為一組，其中后一組得分較高，提示其整體質量相對較好。主成分分析結果與聚類分析結果、雷達圖分析結果相互印證，進一步說明聚類的分類結果和雷達圖分析結果可靠。

圖5 樣品主成分得分散點圖

3 討論

3.1 試驗條件的選擇

3.1.1 測定指標的選擇 考慮到清熱解毒口服液組成處方較多、成分復雜，多指標測定更利于控制其質量，選定綠原酸、木犀草苷、木犀草素、梔子苷、連翹苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素作為質控指標，但在實際測定時發現，該方法對于木犀草苷和木犀草素的專屬性不強，且陰性模擬樣品中有保留時間相同的色譜雜峰干擾，黃芩素和漢黃芩素含量過低，結果不易判定。故最后選定了該測定方法下專屬性較強且制劑中含量較高的綠原酸、梔子苷、連翹苷和黃芩苷作為定量控制的指標。

3.1.2 波長的選擇 上述選定的4種成分紫外吸收不同，在同一波長下難以獲得理想的靈敏度，故采用DAD采集了4種待測成分在200～400 nm波長范圍內的紫外吸收圖譜，結合液相色譜圖，將波長設定為0～25 min 時326 nm（測定綠原酸）、25～35 min 時238 nm（測定梔子苷）、35～45 min 時230 nm（測定連翹苷）、45～70 min 時276 nm（測定黃芩苷）。

3.1.3 流動相的考察 曾考察了乙腈-水、甲醇-水等不同流動相系統，等度洗脫，結果樣品目標峰不易分離，導致儀器重復性較差。查閱文獻[11]發現水相中加入一定比例的酸可提高待測成分與鄰近雜峰的分離度，且可改善峰形，經過進一步考察，確定采用甲醇-0.1 %磷酸溶液作為流動相系統，梯度洗脫，可獲得理想的色譜圖。

3.2 質量評價模式

本研究采用HPLC建立了清熱解毒口服液中4種主要成分的含量測定方法，并基于多元統計對不同企業樣品進行了綜合分析和分類，發現不同企業樣品質量差異較大。結果顯示，雷達圖分析結果、聚類分析結果與主成分分析結果一致，I、G、E、O、K、A企業為一類，其樣品質量有所欠缺；J、H、B、P、N企業為一類，其樣品整體質量相對較好。

4 結論

本研究基于HPLC和多元統計建立了不同企業清熱解毒口服液的質量評價模式，可高效、準確地對測定不同生產企業的樣品并對其質量進行評估分類。主成分分析發現，綠原酸、梔子苷、連翹苷和黃芩苷含量的高低對清熱解毒口服液質量影響均較大，提示對于清熱解毒口服液的質量評價不可僅局限于單一指標，應采用多指標進行質量的綜合評估。綜上，本研究建立的清熱解毒口服液HPLC含量測定，基于雷達圖分析法、聚類分析法和主成分分析法，可對不同企業清熱解毒口服液的質量進行全面系統的評價和分類。