永州煙區煙草花葉病病毒株系調查與分析

周向平，許清孝，劉 峰，周 立，張洪波，樊 建，袁志輝

（1. 湖南省煙草公司永州市公司，湖南 永州 425100；2. 湖南科技學院，湖南 永州 425199；3. 湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南 永州 425199）

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是煙草花葉病毒屬的代表種，也是研究最為廣泛的病毒之一。TMV的寄主非常多，可浸染包括30個科的310多種植物[1]。TMV的基因組為單股正鏈RNA，全長6 395堿基對，共編碼4個開放閱讀框（ORF），其中外殼蛋白（coat-protein，CP）編碼基因在TMV病毒分類中是一個主要的相關基因[2]。TMV在不同植物寄主上有許多不同的株系，我國主要有TMV-U1、TMV-U2、蘭花株系、番茄株系、葫蘆科株系、車前草株系和豆類株系；煙草上的株系主要有TMVN、TMV-OM、TMVRS、TMV-U1、TMVC、TMV-Vulgare、TMVY[3]。TMV是煙草的主要病原物之一，感染后煙葉產量下降、品質變劣，常造成巨大的經濟損失[4-6]，且目前還缺乏有效的防控措施[7]。近年來，隨著煙草漂浮育苗技術的普遍應用，由TMV引起的花葉病在煙草上發生嚴重[8]，對煙葉品質及產量均造成較大影響。同時，永州不同縣區氣候的差異性及其獨特的地理地質特點也導致了煙草花葉病毒的變異頻繁，出現了多種癥狀類型。為了查明永州主要煙區TMV株系的歸屬，筆者以采自永州不同煙區的病樣為材料，通過對TMVCP基因的克隆及序列分析，并與國內外報道的主要株系（或分離物）的同一基因進行比較，研究其病毒株系的歸屬，以期為TMV的防控及快速檢測方法的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試樣品供試樣品分別于2020年4月27—29日采集自永州市江永縣、新田縣、寧遠縣、江華縣、藍山縣、道縣等不同煙草種植區，采樣植株表現出花葉、葉片皺縮、植株矮化等癥狀。

1.1.2 引物與試劑根據已報道的序列（福建分離物，登錄號：AF165190；山西分離物，登錄號：JF 920727），設計并合成擴增TMVCP基因部分序列引物（見表1）。植物總RNA 提取試劑盒Transzol購自北京全式金公司，反轉錄試劑盒和pGEM-T Easy載體購自Promega公司，DNA聚合酶購自TaKaRa，其他試劑為國產分析純。

表1 TMV CP基因序列擴增引物

1.2 方 法

1.2.1 TMV RNA提取利用Transzol試劑盒提取植物總RNA。提取到的總RNA通過甲醛變性瓊脂糖電泳，確定抽提RNA的完整性和DNA污染情況。

1.2.2 RT-PCR反轉錄TMV RNA參照王莉爽等[9]采用RT-PCR兩步法對TMV的CP基因序列進行擴增。

1.2.3 產物克隆及測序RT-PCR擴增產物經DNA回收試劑盒連接到pGEM-T Easy載體，轉化到大腸桿菌DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB培養基上，篩選陽性克隆。所篩選的陽性克隆送上海華大基因有限公司進行測序。

1.2.4 序列分析利用DNAStar軟件進行序列拼接和分析；以獲得CP基因序列為基礎，用Mega 7.0程序的鄰近連接法（Neighbor-Joining，NJ）構建TMV病毒CP基因組序列的系統進化樹，其各分支的可信度用Bootstrap檢測（1 000次重復）[10]。從NCBI數據庫中選擇15個代表性TMVCP基因序列用于CP基因比較和分析，這15個代表性序列的TMV病毒及其序列登錄號為：Fujian（AF395129.1），Africa（AY360447.1），Jimo（HE818443.1），Chongqing（EF183504.1），Fujian-U1（AF165190.1），Henan（GU324660.1），Japan（D63809.1），Korea（X68110.1），Kunming（AF516912.1），Shandong（DQ014551.1），Shanxi（JF920727.1），South Korea（DQ981481.1），USA（NC_001367.1），Vietnam（AM412008.1），Zhejiang（GQ280795.1）。

2 結果與分析

2.1 CP基因擴增結果

經電泳和測序驗證，設計的4對引物中，03號引物能獲得較好的TMVCP基因擴增結果。故后續的所有樣品擴增均采用該引物。

從江永縣、新田縣、寧遠縣、江華縣、藍山縣、道縣6個縣區23個鄉鎮采集的煙草普通花葉病樣品91個，經總RNA提取和RT-PCR擴增后進行電泳。結果顯示，有83個樣品的擴增結果為陽性，陽性率為91.21%（見圖1）。擴增陰性的樣品主要來自道縣和藍山縣，這2個縣的普通花葉病發病情況普遍較輕，采集樣品難度較大。道縣樣品的陽性率為80.00%，藍山縣樣品的陽性率為78.57%，均低于綜合陽性率，這從側面反應了這2個縣的普通花葉病發病與其他病害相混雜的情況較其他縣多。另外，由于所采集的樣品中混雜有相似癥狀但不是TMV感染所造成的情況，因此樣品的陽性率低屬正?，F象。

圖1 煙草普通花葉病樣品TMV擴增電泳結果

2.2 測序結果及分析

擴增產物經DNA回收試劑盒連接到pGEM-T Easy載體，轉化到大腸桿菌DH5α，挑選篩選陽性克隆。對所篩選的陽性克隆每個樣品隨機選取2個送上海華大基因有限公司測序。所得序列與NCBI數據庫比對后發現，所有序列均為TMVCP基因。從NCBI數據庫中選擇代表性TMVCP基因序列，與所有陽性樣品序列一起構建系統發育樹（見圖2）。該系統發育樹中，所有獲得的TMVCP基因與挑選的15個代表性序列一起分成了2個大枝。其中1大枝僅含有43個CP基因序列，未與NCBI數據庫的15個代表性序列中的任何1個聚在一起，且永州煙區6縣均有樣品分布在其中。這43個樣品的BLAST比對結果，序列相似性較低，僅95.6%～97.3%，且變異樣品中有65.3%是采自發病率10%以上的煙田。系統發育樹中另1大枝則由其他40個CP基因序列和15個代表性序列聚在一起，永州煙區6縣均有樣品分布在該大枝中。這40個樣品序列除日本分離物和我國山東分離物外，美國分離物、越南分離物、非洲分離物、韓國分離物以及我國的山西分離物、河南分離物、重慶分離物、福建分離物和浙江分離物均可以在永州煙區6個縣的樣品中找到親緣種。

永州煙區各縣的TMV株系雖然混雜，但各縣也存在一些主要的分離物親緣種，如表2所示，TMV親緣種寧遠縣以山西和福建分離物為主，還包括云南、韓國、日本和河南分離物；新田縣以山東分離物為主，還包括重慶、韓國、浙江、云南、福建分離物；藍山縣以山西分離物為主，另有2個樣品與重慶分離物親緣關系最近；道縣以福建和山東分離物為主，另有2個樣品分別與重慶和美國分離物親緣關系最近；江華縣以山西和福建分離物為主，還包括重慶、非洲和越南分離物；江永縣以福建分離物為主，只有1個樣品與山西分離物的親緣關系最近（表2）。由此可見，永州煙區的TMV主要親緣種包括山西、福建、山東分離物，其中尤以福建分離物所占比例最大，達到33.3%，其次是山西分離物，所占比例為28.6%。

3 結論與討論

永州煙區獲得的TMVCP基因序列構建系統發育樹后分成2大枝。其中1大枝含有43個CP基因序列，且未與代表性序列中的任何1個聚在一起，永州煙區6縣均有樣品分布在該大枝中，說明永州煙區發病樣品中的TMV與現有代表性序列存在一定差異，即均發生了不同程度的變異。43個樣品的BLAST比對結果僅95.6%～97.3%的低序列相似性也可以說明部分區域的TMV已經發生了變異。變異樣品中有65.3%是采自發病率10%以上的煙田，如道縣梅花鎮和四馬橋鎮、江華縣大石橋鄉和白芒營鎮。因此，在永州煙區的普通煙草花葉病毒的防控中，要特別注意高致病力或高傳播力變異株的出現。另1大枝含有40個CP基因序列且與代表性序列聚在一起，這40個樣品序列，也同樣包含永州煙區所有6個縣的樣品，也就是說，數據庫中存在的國內外代表性株系均可以在永州煙區的樣品中找到親緣種，說明永州煙區普通花葉病毒的株系來源混雜。由于永州煙區普通花葉病毒的株系混雜，相互之間的多重雜交重組可以使得病毒進化進程加快，從而更容易產生危害程度高的高致病力或高傳播力的株系，因為重組是病毒進化的重要途徑之一，可改變病毒致病力[11]，擴大其寄主范圍[12-13]。因此，在永州煙區普通花葉病的防控中，應特別注意農事操作的規范性，在轉場不同鄉鎮、不同村組，甚至是不同地塊進行農事操作時，應做好清潔消毒工作，避免病毒的傳播，特別是避免造成病毒株系進化的加快。