原發免疫性血小板減少癥激素敏感與抵抗者血清蛋白質組學的研究

張揚 白菊 張王剛 何愛麗

(西安交通大學第二附屬醫院血液科，陜西 西安 710004)

原發免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia ，ITP)是一組獲得性免疫介導的單獨血小板過度破壞所致的出血性疾病[1]。ITP的一線治療方案為糖皮質激素(潑尼松或地塞米松)，有效率為70%～80%，長期有效率為30%～50%，治療的預期效果很大程度上取決于糖皮質激素敏感與否，目前還缺乏統一的定義和評判標準；經驗是足量治療3～4周，如果潑尼松標準劑量治療4周無效則定義為糖皮質激素抵抗[2]。目前實驗室尚無特異性的指標及分子標志物來早期區分是否激素治療有效，4周的激素治療對激素抵抗患者并不能獲益，延誤治療時機的同時還要承受著激素相關的副作用，如感染、高血壓、高血糖、潰瘍、股骨頭壞死、肥胖等等。ITP患者糖皮質激素抵抗的機制復雜且與多種因素相關，但目前只是從某一角度著手進行的研究[3-5]。抵抗機制不僅是基因水平的改變，也涉及到蛋白質層次的，特別是蛋白質信號分子的改變，因此，從蛋白水平和整體角度研究尋找糖皮質激素抵抗與糖皮質激素敏感的差異蛋白是可能的[6-7]。不同功能表面的磁珠蛋白分離聯合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight laths spectrometer，MALDI-TOF-MS)及Cliprotools所組成的CLIPROT系統是集分離、純化、檢測和分析于一體的全新富有特色的蛋白組學技術，在實體瘤和耐藥機制研究中廣為應用[8-11]。本實驗中我們通過該技術對ITP患者血清樣本中不同蛋白質標志物分離純化，進一步應用質譜技術分析獲取血清蛋白質表達譜，以尋找差異表達的蛋白質，以期為臨床早期判斷ITP患者糖皮質激素治療有效與否提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集 2016年3月～2017年3月西安交通大學第二附屬醫院住院患者共 60 例 ITP 血清樣品，收集初入院未使用任何藥物時的外周血血清。所有患者均符合國內 ITP 的診斷標準[12]，隨訪4周，按臨床診療效果分組：①糖皮質激素敏感組：完整激素治療4周后(潑尼松1 mg/kg，療效穩定后逐漸減量) PLT≥30×109/L且大于基線水平2倍，共32例，其中男性14例，女性18例，中位年齡44.5(18～75)歲。②糖皮質激素抵抗組：完整激素治療4周后，PLT<30×109/L或不足基線2倍或者有活動性出血，共28例，其中男性10例，女性18例，中位年齡37.5(19～70)歲。

1.2 標本的采集和處理 采集患者空腹時外周血3 mL，置于無抗凝劑的干燥管中，室溫靜置1 h，離心機室溫離心10 min(600g)，離心結束后吸取血清部分，0.5 mL/管分裝3管，-80℃冰箱凍存備用。

1.3 試劑與儀器 基質、無水乙醇、丙酮、弱陽離子交換磁珠試劑盒均購自美國布魯克·道爾頓公司。200 μL的Orcugen樣品管購自西安博精生物技術有限公司。CLINPROT系統為美國布魯克·道爾頓公司產品，包括磁珠分離器、基質輔助激光解吸離子飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS,Microflex)、Anchorchip靶、Clinprotools2.2、FlexControl2.2采集軟件、分析軟件Flexanalysis3.0。母液配置：基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinna- mic acid,HCCA)1.2～1.4 mg，加入1～1.2 mL丙酮稀釋制成1.2 mg/μL的HCCA母液。母液可在-20℃保存2 d。無水乙醇(1∶2)混合均勻即得0.4 mg/mL HCCA的基質溶液，基質溶液當天配置當天使用。

1.4 樣本的制備 室溫下溶解凍存的外周血清標本。

1.4.1 運用弱陽離子交換磁珠結合血清蛋白 將磁珠試劑盒自4℃冰箱取出，手動上下搖動完全混勻其中的弱陽離子磁珠懸浮液1 min，取10 μL 磁珠結合緩沖液(BB)加入200 μL Orcugen樣品管中，再加入10 μL 磁珠至樣品管，用加樣槍吸打混勻，避免起泡；然后向Orcugen樣品管中加5 μL血清，用加樣槍吸打至少5 次使其混勻，避免起泡；室溫靜置5 min；將Orcugen樣品管放入磁珠分離器。完全混勻磁珠試劑盒中的弱陽離子磁珠懸浮液，在200 μL Orcugen管中加入10 μL磁珠結合緩沖液和10 μL磁珠，混勻后再加入5 μL血清標本，混勻，室溫靜置5 min后放入磁珠分離器，貼壁1 min，吸去懸浮的液體后加入100 μL磁珠清洗緩沖液，靜置，磁珠與液體分離后吸去懸浮的液體，完全吸干凈懸浮的液體后取下樣品管，加入5 μL磁珠洗脫緩沖液，混勻磁珠，放入磁珠分離器，貼壁2 min，將上清移至已加入5 μL穩定緩沖液的0.5 mL樣品管，混勻。

1.4.2 Microflex MALDI-TOF質譜分析 Anchorchip靶板上點1 μL洗脫樣品，室溫干后，點1 μL基質(已提前制備)，室溫干，靶板放入Microflex質譜儀中，標準品校正后檢測樣本，使用FlexControl 2.2軟件采集數據，收集范圍700～10000 Da，獲得不同質荷比(mass charge ratio，m/z)的蛋白峰構成的質譜圖。

1.5 統計學分析 使用ClinProTools軟件分析數據，統計學分析采用軟件自帶的統計學算法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 應用Clinprot系統模擬分析激素敏感組和激素抵抗組激素治療前的血清指紋圖 將采集軟件采集到的血清圖譜經基線消減、校正和歸一后導入分析軟件，激素抵抗組和激素敏感組激素使用前血清的質譜結果分析結果，見圖1。通過ClinProtools2.2軟件對兩組血清樣品的質譜數據進行對比分析，在分子量700～10000 Da的范圍內共得到41個差異蛋白質表達峰，但差異均無統計學意義(均P>0.05)。

圖1 應用Clinprotools 2.2軟件模擬和分析激素抵抗組和激素敏感組激素使用前血清蛋白質指紋圖譜

2.2 應用Clinprot系統模擬分析激素敏感組激素使用前后血清指紋圖 將采集軟件采集到的血清圖譜經基線消減、校正和歸一后導入分析軟件，對激素敏感組激素使用后和激素敏感組激素使用前血清的質譜結果分析，見圖2。通過ClinProtools 2.2軟件對這兩組血清樣品的質譜數據進行對比分析，在分子量700～10000Da范圍內共得到55個差異蛋白質表達峰，其中5個有統計學意義的差異蛋白質峰(P<0.05)，激素使用后表達上調的蛋白質有4個，下調的有1個(表1)。

圖2 應用Clinprotools 2.2軟件模擬和分析激素敏感組激素使用前后血清蛋白質指紋圖譜

表1 激素敏感組激素使用前后差異表達蛋白質

2.3 應用Clinprot系統模擬分析激素抵抗組激素使用前后血清指紋圖 將采集軟件采集到的血清圖譜經基線消減、校正和歸一后導入分析軟件，對激素抵抗組激素使用前后血清的質譜結果(圖3)。通過ClinProtools 2.2軟件對這兩組血清樣品的質譜數據進行對比分析，在分子量700～10000 Da范圍內共得到56個差異蛋白質表達峰，但差異均無統計學意義(均P>0.05)。

圖3 應用Clinprotools 2.2軟件模擬和分析激素抵抗組激素激素使用前后血清蛋白質指紋圖譜

3 討論

除了運用在腫瘤的早期診斷中外，蛋白組學方法也廣泛地應用于耐藥研究中；幾乎所有的病理生理過程中，藥物和環境因子的作用都依賴于蛋白質，并引起相應蛋白質的變化，同時蛋白質組的變化也能提供該過程變化的信息[13-15]。在疾病出現明顯的癥狀前都會有一些蛋白質發生變化，尋找這些與疾病相關的蛋白，對發病機制的闡明，建立診斷模型，研究疾病的耐藥機制具有重要意義。Feng等[16]通過蛋白組學的方法研究甲氨蝶呤的耐藥發現二氫葉酸脫氫酶(DHFR) 在甲氨蝶呤的耐藥中起很大作用。Woronieck等[17]通過蛋白組學方法發現，4144 Da的分子是區分兒童腎病綜合征糖皮質激素抵抗與糖皮質激素敏感的最有意義的蛋白質分子。黃艷軍等[18]通過2-D凝膠電泳聯合MALDI-TOF-MS的方法發現了兒童微小病變型腎病綜合征患者激素敏感與抵抗相關的12個差異蛋白，與激素敏感蛋白圖譜比較，在激素耐藥蛋白圖譜上蛋白酶抑制劑、α1B糖蛋白、IRAK4 表達下調，其余9 種蛋白表達上調。潘艷艷等[13]在MALDI-TOF-MS方法及雙向電泳發現，腎病綜合征中的激素耐藥組和激素敏感組的兒童尿液中具有12個差異表達的蛋白存在，其中包括尿液中α1-抗胰蛋白酶和轉鐵蛋白。本研究治療前激素抵抗和激素敏感患者血清蛋白指紋對比未得到具有統計學意義的差異蛋白，考慮可能與樣本量不足相關，或者是差異蛋白的分子量不在700～10000 Da范圍內。

激素敏感患者激素治療前后的血清蛋白指紋圖譜相比較，在激素敏感組激素使用后表達上調的蛋白質有4個，分子量分別為9289.84、4644.96、7764.95和4964.12 Da，下調的有1個，分子量為6666.94 Da。激素抵抗患者激素治療前后的血清蛋白指紋圖譜相比較，未得到具有統計學差異的蛋白。由此可以推測，激素的效應最終可能作用于血清中，引起了血清中蛋白的變化，使得血小板數值最終升高。

將激素敏感前后比較得到的差異蛋白峰與我們前期實驗中ITP和健康對照比較得到的差異蛋白峰相比較，發現其存在極為相似的分子量，激素敏感組前后比較得到的蛋白相對分子量4644.96 Da，峰均值在激素使用前后分別為1.05和2.4，使用后較前上調，ITP標志蛋白中也存在分子量為4644.92 Da的蛋白，峰均值在ITP組和健康對照中分別為1.17和2.18[19]，若推測這2個蛋白為同一蛋白，則此蛋白在ITP患者中較正常者下調，但經過激素治療后上調至接近正常者水平，則可認為其與ITP的發病和激素的作用密切相關。同理，還有相對分子量7764.95和7764.78 Da，4964.12和4964.36 Da，均在ITP患者中表達較正常下調，經過激素治療后上調至接近正常者水平。其中7764.95 Da，與血小板第4因子(PF4)7800 Da極為接近，因一個氨基酸的相對分子量為75～220 Da之間，推測此蛋白是PF4因子，PF4由激活的血小板分泌，在巨核細胞中合成的貯存于a-顆粒中的大分子蛋白聚糖,具有中和肝素,炎癥趨化,抑制血管形成和巨核細胞生長的功能[20-21]。細胞因子是參與骨髓造血的重要的調控因子，有研究認為PF4是巨核細胞和血小板生成的調控因子，與巨核細胞的增殖、成熟和分化密切相關，但具體的調控機制還不清楚[22-25]。這3個蛋白與ITP的發病和糖皮質激素的作用可能相關，有待加大樣本量，對其進行驗證以及純化，進一步鑒定并分析其功能，對ITP的發病機制和糖皮質激素的作用機制有著重要意義。

4 結論

激素敏感者治療前后存在5個差異表達的蛋白，可能與ITP的激素治療效果密切相關。