LC3、MMP-14及PD-1在喉癌中的表達及與病理特征和預后的相關性*

吳筱蔓 周興星 顧翔 喻慧嶺 潘曉玲 周敏

(華中科技大學附屬武漢中心醫院，湖北 武漢 430000)

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，近年來，隨著飲食習慣的改變，我國喉癌發病率及死亡率呈明顯增高趨勢，嚴重威脅患者的健康與生命。有學者報道，微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubule-associatedprotein1 lightchain3，LC3)是編碼自噬相關蛋白的重要基因，與腫瘤的發生有著密切關系[1]。基質金屬蛋白酶(Recombinant Matrix Metalloproteinase，MMPs)可降解血管基底膜及其他基質成分，加速腫瘤的侵襲，在腫瘤侵襲及轉移中起著重要作用[2]。現有較多學者報道，程序性死亡因子1(Mouse Programmed Death 1，PD-1)具有負向調節T細胞活性的功能，在惡性腫瘤中呈高表達狀態[3-5]。本研究擬通過免疫組織化學方法檢測LC3、MMP-14及PD-1在喉癌及非喉癌組織中的表達情況，并分析上述三種蛋白與喉癌患者病理特征的關系，以探討LC3、MMP-14及PD-1表達情況對患者預后的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016年7月～2018年7月于我院收治的36例喉癌患者的臨床資料，所有患者均經手術或穿刺活檢證實，共36份喉癌組織標本設為觀察組。其中男性21例，女性15例；年齡45～78歲，平均年齡(55.59±3.57)歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期21例；吸煙量>400(年×支/日)者20例，吸煙量≤400(年×支/日)者16例。納入標準：①所有患者均經實驗室、影像檢查確診為喉癌。②預測生存期在6個月以上者。③臨床、影像資料完整。④均選取同一標本，分別檢測LC3、MMP-14及PD-1水平。排除標準：①合并其他惡性腫瘤、器官衰竭等嚴重者。②腫瘤出現遠處轉移者。③術前已進行化療或放療治療者。同時選取上述36例喉癌患者手術切除的正常組織標本作為對照組。本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人多克隆抗體LC3、MMP-14及PD-1均由美國Santa Cruz公司提供，DNA顯色劑由北京中杉金色橋生物技術公司提供，抗體免疫組織化學試劑盒由上海嶸葳達實業有限公司提供。

1.2.2 指標檢測 采用免疫組化SP染色。將喉癌組織和正常組織標本經常規石蠟切片、脫水，加入100%、95%、85%梯度酒精各5 min，自來水沖洗。3%過氧化氫溶液-甲醇室溫10 min，蒸餾水沖洗3 min，pH9.0EDTA緩沖液煮沸20 min抗原修復，加一抗(1∶70)室溫放置2 h。用DNA顯色劑顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察LC3、MMP-14及PD-1，檢測嚴格按照說明書進行，檢測完成后由2位高年資醫師雙盲法閱片。

1.2.3 判斷標準 陽性判斷標準：腫瘤細胞胞質或細胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒。陽性細胞占比：0分(無陽性)、小于30.00%(1分)、大于等于30.00%(2分)。染色強度評分：0分(無色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)；陽性細胞所占百分比小于26%為1分，陽性細胞所占百分比26%～50%為2分，陽性細胞所占百分比51%～75%為3分，陽性細胞壁大于75%為4分。根據兩者相乘結果進行評判：小于3分(-)、3分(+)、4分(++)、5分(+++)。陽性率=陽性例數/總例數×100%。

2 結果

2.1 LC3、MMP-14及PD-1在不同組織中的表達 喉癌組織中的LC3、MMP-14及PD-1陽性表達率分別為36.11%、72.22%、58.33%；正常組織中的LC3、MMP-14及PD-1陽性表達率分別為72.22%、41.67%、8.33%；兩者LC3、MMP-14及PD-1陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 LC3、MMP-14及PD-1在不同組織中的表達[n(×10-2)]

圖1 免疫組化染色(500×)

2.2 喉癌組織中LC3、MMP-14及PD-1表達與臨床病理特征的關系 選取有意義的單因素進一步行多因素分析，LC3、MMP-14及PD-1表達情況與臨床分期、淋巴結轉移、分化程度有關(P<0.05)，見表2。

表2 喉癌組織中LC3、MMP-14及PD-1表達與臨床病理特征的關系

2.3 36例喉癌患者兩年生存率 本研究以門診復查或電話隨訪的方式進行為期2年的隨訪，截止于2020年7月，36例喉癌患者共死亡10例，存活26例，存活率為72.22%。

2.4 LC3、MMP-14及PD-1表達與喉癌預后的關系 LC3表達陰性及表達陽性中位生存期分別為(28.65±2.49)個月、(32.92±1.99)個月，MMP-14表達陰性及表達陽性中位生存期分別為(30.46±1.48)個月、(24.48±1.79)個月，PD-1表達陰性及表達陽性中位生存期分別為(25.71±2.04)個月、(19.40±1.63)個月。生存分析顯示LC3表達陽性者生存期較長，MMP-14及PD-1表達陰性者生存期較長，Keplan-meier生存曲線明顯不同(P<0.05)，見圖2～4。

圖2 LC3陽性表達與LC3陰性表達期比較

2.5 影響喉癌患者預后生存的單因素和多因素分析 年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、吸煙史非影響喉癌患者預后生存的相關危險因素(P>0.05)，臨床分期(Ⅲ～Ⅵ期)、有淋巴結轉移、高分化、LC3表達陽性、MMP-14表達陽性及PD-1表達陽性為影響喉癌患者預后生存的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

圖3 MMP-14陽性表達與MMP-14陰性表達期比較

圖4 PD-1陽性表達與PD-1陰性表達期比較

表3 影響喉癌患者預后生存的單因素和多因素分析

3 討論

喉癌發病機制至今尚未闡明，較多學者研究認為，喉癌的發生可能與空氣污染、煙酒過度、職業性接觸致癌物等因素有關[6-8]。隨著分子水平的發展，特別是癌基因對腫瘤發生、發展的相關機制研究成為臨床醫師關注的熱點。近年來，有不少學者報道，生物學指標對喉癌的診斷及預后評價有重要意義[9-11]。

自噬是真核細胞降解蛋白的重要途徑，有助于細胞成分和細胞器的正常更新[12]。相關研究指出，真核細胞中溶酶體依賴的內源性底物均會經過自噬等自我降解的過程，影響細胞清除廢物、生長發育、重建結構等過程，并在這些過程中發揮作用[13]。LC3被鑒定是自噬溶酶體最基本的組成成分，其表達強度與自噬活性成正比，當LC3水平降低時，細胞自噬能力下降，細胞惡性增殖速度加快，而變異、損傷的細胞得不到有效及時的清除，則會發生癌變[14-15]。同時LC3缺失或下調，會激活多種癌基因，誘發癌細胞生長，促使喉部組織惡性病變，加重病情進展[16-18]。研究發現喉癌組織中LC3陽性表達率明顯低于正常組織陽性表達率(P<0.05)，與韓冰等[19]研究結果相符。提示喉癌組織中存在LC3表達缺失或下調，會導致細胞自噬能力下降，惡性細胞快速增殖，導致喉癌發生。

既往文獻資料報道，MMP-14是MMPs家族中主要的特殊蛋白酶，可直接降解、破壞腫瘤患者細胞外基質及基底膜，具有促進新生血管生成的作用[20-21]。MMP-14可以啟動細胞表面多個蛋白級聯反應，直接降解與破壞腫瘤患者的細胞外基質和基底膜，打破阻擋腫瘤細胞因子浸潤的屏障。PD-1是負性共刺激信號之一，在淋巴細胞活化過程中，被誘導表達的一個免疫抑制性受體，與機體免疫反應有關[22]。既往研究報道MMP-14、PD-1在惡性腫瘤中陽性表達率明顯增高[23]，與本研究結果結論一致。分析MMP-14、PD-1在喉癌組織中陽性表達率較高的原因是MMP-14可轉錄調節血管內皮生長因子水平，會促進喉癌細胞的血管生成，加重癌細胞侵襲[24]。PD-1與其配體結合后，誘導T細胞免疫耐受，可抑制腫瘤抗原特異性T細胞活化，給喉癌細胞提供了逃避機體免疫監控和殺傷的機會，促進了癌細胞增殖、轉移[25]。由此可見，二者對腫瘤的侵襲、轉移均發揮了重要作用。

臨床分期及淋巴結轉移為臨床公認的判斷喉癌侵襲程度與預后的關鍵性指標。本研究中高分化喉癌組織LC3陰性表達率更低，MMP-14及PD-1陽性表達更高，也表達腫瘤分化程度與LC3、MMP-14及PD-1表達密切相關，這一結論與文獻報道相符[26]。已有相關文獻證實MMP-14、PD-1在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中的表達與患者預后不良密切相關[27]。本研究結果表明，LC3、MMP-14及PD-1的表達與臨床分期、淋巴結轉移、分化程度有關(P<0.05)。

生存分析顯示，LC3表達陰性、MMP及PD-1表達陽性者2年內平均生存時間明顯短于與LC3表達陽性、MMP-14及PD-1表達陰性者(P<0.05)，提示LC3、MMP-14及PD-1與喉癌患者預后存在密切聯系。亦說明LC3的缺少或下調影響細胞凋亡過程，增加了細胞突變的幾率，大幅提高了喉癌的發生率；MMP-14及PD-1高表達腫瘤的侵襲力，促進了腫瘤的發生、發展[28]。但本研究仍存在不足，可能導致研究結果存在偏倚，今后我們將改善相關研究方法，進一步擴大樣本范圍，以降低實驗誤差，并對LC3、MMP-14及PD-1的作用機制進行深入研究。

4 結論

LC3陰性表達及MMP-14、PD-1陽性表達會增加喉癌患者死亡率，影響喉癌患者預后生存率。LC3、MMP-14、PD-1可作為判斷喉癌患者腫瘤進展及預后的標志物，對評估患者預后具有重要意義。