miR-20a-5p通過下調BMPR2促進人腦微血管內皮細胞增殖和抑制凋亡*

蒲舉 季一飛 龍繼發 周華勇 楊旭 張揚威 柳華

(1.南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院神經內科，四川 南充 637000；2.西南交通大學附屬醫院·成都市第三人民醫院神經內科，四川 成都 610031)

血腦屏障通過調節必要的營養素、離子和激素的運輸來幫助維持腦穩態，同時由于復合膜而阻止神經毒素或病原體進入大腦；其完整性的喪失與阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和多發性硬化癥以及腦腫瘤相關[1-2]。腦微血管的內皮細胞是組成血腦屏障的重要細胞類型，有助于血腦屏障的完整性，并有助于控制運輸過程[1]。微小RNA(microRNA，miRNA/miRs)是約22個核苷酸的單鏈RNA分子，通過與特定靶標mRNA的3′非翻譯區(3′ UTR)結合來調節基因表達[3]。最近的研究表明，miRNA在內皮細胞損傷等神經系統疾病中異常表達，與疾病進展密切相關[4]。miR-20a-5p被報道在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的內皮細胞損傷中顯著下調，其過表達可以減輕ox-LDL誘導的內皮細胞損傷[5]。但miR-20a-5p在人腦微血管內皮細胞中的潛在功能尚不明確。本研究生物信息學預測出miR-20a-5p和骨形成蛋白2型受體(Bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)存在結合位點，BMPR2可能是miR-20a-5p的靶基因。研究表明，BMPR2的下調促進肺動脈細胞的增殖過程[6]。但miR-20a-5p是否通過靶向BMPR2參與人腦微血管內皮細胞的增殖和凋亡，目前仍未可知。基于此，本研究考察miR-20a-5p對人腦微血管內皮細胞增殖和凋亡的影響，并通過miR-20a-5p和BMPR2之間的靶向關系研究，旨在探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 永生化人腦微血管內皮細胞(hCMEC/D3)來自美國典藏培養物中心，內皮細胞培養基EBM-2購自瑞士Lonza公司，噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自美國Sigma公司，PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR?Premix Ex TaqTM購自大連Takara Bio公司，抗BMPR2、抗細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、抗活化的的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)、抗磷酸化-磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)、抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、抗β肌動蛋白(β-actin)Ⅰ抗、辣根過氧化物酶偶聯的IgG Ⅱ抗購自美國Abcam公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司。

1.2 細胞培養 參照文獻[7]的報道，將hCMEC/D3在含5%胎牛血清的EBM-2培養基中培養，并置于37℃、5% CO2培養箱生長。每2 d更換一次培養基。

1.3 脂質體轉染 miR-20a-5p mimics、陰性對照miR-NC、miR-20a-5p inhibitor(anti-miR-20a-5p)、陰性對照anti-miR-NC、BMPR2小干擾RNA(si-BMPR2)、小干擾RNA(si-NC)、過表達質粒(pcDNA-BMPR2)、空載pcDNA-NC從上海GenePharma公司獲得。將hCMEC/D3分為miR-NC組(轉染miR-NC)，miR-20a-5p組(轉染miR-20a-5p mimics)、si-NC組(轉染si-NC)、si-BMPR2組(轉染si-BMPR2)、pcDNA-NC組(轉染pcDNA-NC)、pcDNA-BMPR2組(轉染pcDNA-BMPR2)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-20a-5p組(轉染miR-20a-5p inhibitor)、miR-20a-5p+pcDNA-NC組(共轉染miR-20a-5p mimics和pcDNA-NC)、miR-20a-5p+pcDNA-BMPR2組(共轉染miR-20a-5p mimics和pcDNA-BMPR2)。hCMEC/D3接種于6孔板，其融合度為70%時，通過Lipofectamine 2000按照上述分組進行轉染。37℃和5% CO2條件下溫育6 h，將培養基更換為常規培養基，再培養48 h。轉染48 h后，從hCMEC/D3中提取總RNA和蛋白，分別使用實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和免疫印跡(Western Blot)測定miR-20a-5p和BMPR2表達，評估轉染效率。

1.4 qRT-PCR檢測miR-20a-5p表達 為了檢測miR-20a-5p表達，使用TRIzol試劑從hCMEC/D3提取總RNA。然后，通過測定260和280 nm處的吸光度來確定RNA濃度，A260/A280比為1.8～2.0表示可接受的純度。接下來使用PrimeScriptTMRT Master Mix，將2 μg總RNA反轉錄為cDNA。于ABI 7500 Real-Time PCR系統熱循環儀上使用SYBR?Premix Ex TaqTM進行PCR。用于擴增的引物為miR-20a-5p 5′-GCCCGCTAAAGTGCTTATAGTG-3′(正向引物)和5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′(反向引物)。U6：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAG C-3′(正向引物)和5′-CCAGTGCAGGGAGGT-3′(反向引物)。U6用作內部對照。使用2-ΔΔCt法分析結果。

1.5 Western Blot檢測BMPR2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3、p-PI3K、p-AKT蛋白水平 轉染后的hCMEC/D3用冰RIPA緩沖液提取，使用雙辛可寧酸蛋白質測定法評估蛋白質濃度。然后，將30 μg /泳道蛋白轉移到10% PVDF膜上，并用5%脫脂牛奶在37℃處理2 h封閉膜。PVDF膜沖洗后，將膜與Ⅰ抗在4℃孵育過夜。抗體如下：BMPR2(1∶1000)、CyclinD1(1∶1000)、Cleaved-caspase-3(1∶3000)、p-PI3K(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)和β-actin(加樣對照，1∶3000)。之后與辣根過氧化物酶偶聯的IgG Ⅱ抗(1∶1500)在室溫下孵育1 h。使用增強ECL試劑檢測印跡ImageJ軟件進行光密度分析定量蛋白表達。

1.6 MTT檢測細胞增殖 在96孔板中接種hCMEC/D3，按照1.3中分組進行轉染。48 h后在細胞中加入5 mg/mL的MTT溶液，每孔20 μL，繼續孵育4 h。加入200 μL二甲基亞砜，震蕩培養10 min。在450 nm波長處，記錄Bio Tek酶標儀中細胞的吸光度值OD450nm，以OD450nm代表細胞活性。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的檢測步驟，收集轉染48 h后hCMEC/D3，用10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶黑暗孵育細胞15 min。于FACSCalibur流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.8 熒光素酶報告基因檢測 使用starbase網站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測miR-20a-5p的潛在靶標。對于螢光素酶報告基因分析，使用pGL3螢光素酶報告載體構建BMPR2-3′ UTR野生型(WT)及突變型(MUT)片段，該片段包含miR-20a-5p的結合序列。使用Lipofectamine 2000將BMPR2-3′ UTR-WT或BMPR2-3′ UTR-MUT和miR-20a-5p mimics或miR-NC轉染到hCMEC/D3中。培養48 h后，收獲細胞，通過Promega雙熒光素酶報告基因測定系統測定熒光素酶活性。

2 結果

2.1 過表達miR-20a-5p對hCMEC/D3增殖和凋亡的影響 在hCMEC/D3中轉染miR-20a-5p mimics后，qRT-PCR檢測轉染效率，發現miR-20a-5p組miR-20a-5p表達量遠遠高于miR-NC組(P<0.05)，提示成功構建過表達miR-20a-5p的細胞。Western Blot、MTT和流式細胞儀檢測結果顯示，miR-20a-5p組hCMEC/D3的CyclinD1蛋白量和細胞活性明顯高于miR-NC組，Cleaved-caspase-3蛋白量和細胞凋亡率顯著低于miR-NC組(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 過表達miR-20a-5p對hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

表1 過表達miR-20a-5p對hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

2.2 BMPR2對hCMEC/D3增殖和凋亡的影響 在hCMEC/D3中轉染BMPR2小干擾RNA(si-BMPR2)或過表達質粒(pcDNA-BMPR2)，Western Blot檢測轉染情況，發現si-BMPR2組BMPR2蛋白水平明顯低于si-NC組，而pcDNA-BMPR2組BMPR2蛋白水平明顯高于pcDNA-NC組，提示轉染有效。Western Blot、MTT和流式細胞儀檢測結果表明，與si-NC組比較，si-BMPR2組hCMEC/D3的CyclinD1蛋白表達水平和細胞活性顯著升高，Cleaved-caspase-3蛋白表達水平和細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-BMPR2組hCMEC/D3中CyclinD1蛋白表達水平和細胞活性顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達水平和細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，見圖2、表2。

表2 BMPR2對hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

圖2 Western Blot檢測BMPR2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

2.3 miR-20a-5p靶向BMPR2，調控BMPR2蛋白的表達 采用starbase預測了miR-20a-5p的假定靶標，發現BMPR2-3′ UTR包含miR-20a-5p的互補結合位點。為了證實miR-20a-5p和BMPR2之間的關聯，通過熒光素酶報告基因進行檢測，結果顯示，當用BMPR2-3′ UTR-WT轉染hCMEC/D3時，與miR-20a-5p mimics的共轉染可抑制熒光素酶活性(P<0.05)，而BMPR2-3′ UTR-MUT與miR-20a-5p mimics共轉染對熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。Western Blot進一步檢測表明，與miR-NC組比較，在轉染miR-20a-5p mimics的細胞中BMPR2蛋白水平降低；與anti-miR-NC組比較，轉染anti-miR-20a-5p的細胞中BMPR2蛋白水平升高(P<0.05)，見圖3，表3、4。

表3 miR-NC或miR-20a-5p與BMPR2-3′ UTR-野生型及突變型報告質粒共轉染hCMEC/D3后雙熒光素酶活性檢測

圖3 miR-20a-5p靶向BMPR2，調控BMPR2蛋白的表達

2.4 高表達BMPR2可以逆轉miR-20a-5p對hCMEC/D3增殖和凋亡的影響 Western Blot、MTT和流式細胞儀檢測結果顯示，與miR-20a-5p+pcDNA-NC組比較，miR-20a-5p+pcDNA-BMPR2組hCMEC/D3的BMPR2蛋白水平明顯增加，CyclinD1蛋白水平顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達水平明顯升高，細胞活性明顯降低，細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，見表5、圖4。

表4 Western Blot檢測BMPR2蛋白表達

表5 高表達BMPR2可以逆轉miR-20a-5p對hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

圖4 高表達BMPR2可以逆轉miR-20a-5p對hCMEC/D3增殖和凋亡的影響

2.5 PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達 Western Blot檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達結果表明，與miR-NC組比較，轉染miR-20a-5p mimics明顯提高hCMEC/D3中p-PI3K、p-AKT蛋白水平(P<0.05)；與miR-20a-5p+pcDNA-NC組比較，miR-20a-5p+pcDNA-BMPR2組顯著降低hCMEC/D3中p-PI3K、p-AKT蛋白水平(P<0.05)，見表6、圖5。

圖5 PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達

表6 PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達

3 討論

已有研究證實miRNA在調節細胞增殖、分化、凋亡和血管生成中的重要性[8-9]。miR-20a-5p作為miR-17-92基因簇的成員，在腫瘤等疾病的發生和發展具有關鍵作用[10-11]。例如，胰腺癌中miR-20a-5p表達上調，具有促進腫瘤細胞增殖，并抑制細胞凋亡的作用[12]。在ox-LDL刺激的人主動脈內皮細胞(HAEC)中檢測到miR-20a的表達受抑制，過表達miR-20a可能通過靶向TLR4和NLRP3信號傳導，從而保護HAEC免受ox-LDL誘導的炎性損傷，抑制動脈粥樣硬化的發展[13]。本實驗為了研究miR-20a-5p在人腦微血管內皮細胞中的功能和意義，在細胞中轉染miR-20a-5p mimics以過表達miR-20a-5p。結果顯示，過表達miR-20a-5p使hCMEC/D3的細胞活性、CyclinD1蛋白表達水平顯著升高，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達水平明顯降低。提示miR-20a-5p在人腦微血管內皮細胞發揮促增殖和抗凋亡作用。

BMPR2是細胞增殖、凋亡等過程的重要調控因素，在某些癌癥的發生、腫瘤生長和轉移中起著重要作用[14-15]。既往研究表明，BMPR2在血管內皮細胞、氣道上皮細胞等細胞中表達，能調節內皮細胞的通透性和血管壁的重構參與肺動脈高壓進展[16]。BMPR2的異常造成肺動脈內皮損傷，導致內皮功能障礙[17]。本實驗結果顯示，低表達BMPR2明顯提高hCMEC/D3的細胞活性、CyclinD1蛋白表達水平，顯著減少細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達水平，高表達BMPR2時具有相反的效果。miRNA通過與3′ UTR的互補位點或轉錄本的翻譯區域結合，對目標mRNA進行翻譯抑制或降解[18]。為了確定進一步的機制，本研究使用starbase篩選了miR-20a-5p可能的靶基因，BMPR2被確定為潛在靶點。正如生物信息學所預測的那樣，雙熒光素酶報告基因測定證實了miR-20a-5p對BMPR2的靶向調控作用。此外，為了鑒定miR-20a-5p是否調節hCMEC/D3中BMPR2的表達，Western Blot檢測了轉染miR-20a-5p mimics或miR-20a-5p inhibitor后的BMPR2水平。結果表明，上調miR-20a-5p后，hCMEC/D3中BMPR2蛋白水平降低，而在下調miR-20a-5p后，BMPR2蛋白水平升高。另外，高表達BMPR2可以逆轉過表達miR-20a-5p對hCMEC/D3增殖的促進作用及對細胞凋亡的抑制作用。這些結果表明，BMPR2是miR-20a-5p的功能性靶標。根據報道，PI3K/AKT信號通路的激活有利于miR-126減輕缺血再灌注引起的腦微血管內皮細胞損傷[19]。miR-20a通過激活PTEN/PI3K/AKT途徑誘導肝癌細胞輻射抗性[20]。本實驗中，過表達miR-20a-5p明顯促進hCMEC/D3中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達，而過表達miR-20a-5p激活PI3K/AKT信號通路活性的作用被高表達BMPR2所逆轉。提示miR-20a-5p通過靶向BMPR2并激活PI3K/AKT信號通路，從而參與人腦微血管內皮細胞的增殖和凋亡過程。

4 結論

過表達miR-20a-5p可以促進人腦微血管內皮細胞的增殖，并抑制細胞凋亡，其作用機制與靶向細胞中的BMPR2及提高PI3K/AKT信號通路活性有關，為血腦屏障相關疾病的研究提供了新的線索。