LncRNA MIR4435-1HG對胃癌細胞生物學特性的影響

邊康麒 費素娟 李莉

(徐州醫科大學附屬醫院消化內科，江蘇 徐州 221000)

近年來腫瘤的治療技術顯著提高，明顯改善了患者的預后及生存率，但胃癌患者的5年生存率仍然較低[1]。雖然有大量的研究探究了胃癌的臨床診斷方法以及化療藥物，但胃癌患者依然存在預后較差、復發率高等問題[2]。胃癌細胞的惡性增殖以及侵襲、遷移能力的增強是導致患者腫瘤組織生長、轉移的主要原因，也是患者死亡率較高的主要誘導因素[3]。因此，探究胃癌細胞增殖、侵襲、轉移的分子機制對改善患者的生活質量，提高預后存活率具有重要的意義。長鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA, LncRNA)是一類非編碼蛋白的RNA，可通過介導下游靶基因的沉默或激活，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等生物學過程[4-6]。LncRNA MIR4435-1HG 位于人染色體2q13，目前其對胃癌細胞惡性生物學行為的影響和機制還未知。因此，本文通過下調LncRNA MIR4435-1HG的表達量，觀察其對胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響，為胃癌的靶向分子診斷以及新藥物的研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗主要材料 人胃癌細胞系(MGC-803、MKN45、AGS)以及胃黏膜上皮細胞GES-1購自美國生物標準品收藏中心公司，胎牛血清、RPMI-1640、DMEM培養基、F-12K培養基購自杭州四季青生物工程有限公司，Trizol試劑、Lipofectamine 2000、熒光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction, qPCR)試劑盒、凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司，細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)購自日本株式會社同仁化學研究所，MIR4435-1HG-wt、MIR4435-1HG-mut雙熒光素酶報告載體購自上海吉凱基因公司，Mataigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養 GES-1、MGC-803細胞培養于DMEM培養基，MKN45細胞培養于RPMI-1640培養基，AGS細胞培養于F-12K培養基，各培養基中均含有10%胎牛血清，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細胞培養箱中，每2～3 d換液，加入胰酶傳代(1∶3)。

1.2.2 細胞的轉染 選取對數期AGS細胞，分為對照組、siRNA-NC組、siRNA-MIR4435-1HG組。對照組AGS細胞常規培養，siRNA-NC組、siRNA-MIR4435-1HG組根據Lipofectamine 2000說明書的指示將siRNA NC和siRNA MIR4435-1HG質粒轉染入AGS細胞，繼續培養24 h。siRNA-MIR4435-1HG(5′-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGA GATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′)、siRNA-NC(5′-CACCGCCCAGATTTAAGGGCTAT TTCAAGAGAATAGCCCTTAAATCTGGGCCTTT TTTG-3′)質粒合成于上海吉瑪生物科技有限公司。

1.2.3 qPCR實驗檢測LncRNA MIR4435-1HG表達量 加入Trizol試劑提取各組AGS細胞總RNA，在反轉錄試劑的誘導下合成cDNA。LncRNA MIR4435-1HG、miR-150-5p、U6引物均合成于上海生工公司，見表1。以U6為內參，進行熒光定量PCR，擴增條件為95℃ 10 min，95℃ 20 s，59℃ 30 s，35個循環，2-ΔΔCt法計算LncRNA MIR4435-1HG表達量。

表1 引物序列

1.2.4 CCK-8檢測各組AGS細胞吸光值 收集對照組、siRNA-NC組、siRNA-MIR4435-1HG組AGS細胞，接種至96孔板(1×104個/孔)，5%CO2、37℃分別培養24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8，繼續培養2.5 h，酶標儀檢測450 nm下AGS細胞吸光值(OD值)。

1.2.5 流式細胞術檢測各組凋亡率 在凋亡試劑盒說明書的指示下，將對照組、siRNA-NC組、siRNA-MIR4435-1HG組AGS細胞密度調整為1×106/mL，培養24 h，每孔加入10 μL 磷脂酰結合蛋白V-FITC和5 μL 碘化丙啶，4℃染色15 min，置于流式細胞儀上分析凋亡率。

1.2.6 細胞劃痕實驗檢測劃痕愈合率 分別收集2×105個對照組、siRNA-NC組、siRNA-MIR4435-1HG組AGS細胞，接種至6孔板，5%CO2、37℃培養24 h，待細胞密度為80%～90%，通過一次性吸頭在培養板中劃線，記錄0、24 h劃痕寬度，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7 Transwell實驗檢測各組遷移能力 將Mataigel膠與無血清培養基1∶8混合，吸取50 μL Mataigel膠稀釋液加入Transwell上室膜，37℃靜置2 h，凝固后備用。收集各組轉染24 h AGS細胞，更換為無血清培養基，吸取200 μL(5×105個/mL) AGS細胞懸液加入Transwell上室中，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養基，37℃孵育24 h，棉簽去除殘留AGS細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡下計數。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因 在線數據庫DIANA-LncBase v2(http://www.microrna.gr/LncBase)預測LncRNA MIR4435-1HG與微小RNA-150-5p(micro RNA-150-5p,miR-150-5p)的靶向關系。MIR4435-1HG-wt為野生型雙熒光素酶報告載體，含有與miR-150-5p靶向結合的位點；MIR4435-1HG-mut為突變型雙熒光素酶報告載體，不含與miR-150-5p靶向結合的位點；將MIR4435-1HG-wt和MIR4435-1HG-mut分別與過表達miR-150-5p、miR-NC質粒共轉染，測定AGS細胞中熒光素酶的相對活性。

2 結果

2.1 LncRNA MIR4435-1HG在細胞系中的表達量 與胃黏膜上皮細胞GES-1相比，LncRNA MIR4435-1 HG在MGC-803、AGS、MKN45細胞系中的表達量上調，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。其中在AGS細胞中的表達量相對較高，因此作為后續研究對象。

表2 LncRNA MIR4435-1HG在胃癌細胞系中的表達量

2.2 轉染后AGS細胞中LncRNA MIR4435-1HG表達量的變化 siRNA-NC組AGS細胞中LncRNA MIR4435-1HG表達量與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，但siRNA-MIR4435-1HG組AGS細胞中LncRNA MIR4435-1HG表達量降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 轉染后AGS細胞中LncRNA MIR4435-1HG表達量的變化

2.3 下調LncRNA MIR4435-1HG對AGS細胞增殖、凋亡的影響 siRNA-NC組AGS細胞增殖與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，但siRNA-MIR4435-1HG組AGS細胞增殖在24 h差異不顯著，在48、72 h增殖明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。siRNA-NC組AGS細胞與對照組凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)，但siRNA-MIR4435-1HG組細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，見圖1。

表4 下調LncRNA MIR4435-1HG對AGS細胞增殖的影響

圖1 下調LncRNA MIR4435-1HG對AGS細胞凋亡的影響

2.4 下調LncRNA MIR4435-1HG對AGS細胞侵襲、遷移的影響 siRNA-NC組AGS細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，但siRNA-MIR4435-1HG組AGS細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表5、圖2～3。

表5 下調LncRNA MIR4435-1HG對AGS細胞侵襲、遷移的影響

圖2 下調LncRNA MIR4435-1HG對AGS細胞劃痕愈合率的影響

圖3 下調LncRNA MIR4435-1HG對AGS細胞侵襲的影響

2.5 靶基因的預測和驗證 在線軟件DIANA-LncBase v2預測LncRNA MIR4435-1HG的下游靶基因結果顯示，LncRNA MIR4435-1HG基因3′端非翻譯區域可特異性結合于miR-150-5p，見圖4。雙熒光素酶驗證報告進一步驗證結果顯示，上調miR-150-5p與MIR4435-1HG-wt共轉染較miR-NC組與MIR4435-1HG-wt共轉染降低AGS細胞熒光素酶活性(P<0.05)；但上調miR-150-5p與MIR4435-1HG-mut共轉染對AGS細胞熒光素酶相對活性無明顯影響，見表6。

圖4 LncRNA MIR4435-1HG與miR-150-5p結合位點

表6 雙熒光素酶活性檢測結果

3 討論

胃癌的病理進程與多種病因相關，如吸煙、遺傳因素、飲食習慣等均可誘導胃癌的發生、發展[7]。胃癌患者約95%為腺癌，早發現、早治療是臨床治療胃癌最有效的方法，但由于早期診斷方法的局限性，導致大部分患者確診時已是晚期或已發生轉移[8]。因此明確胃癌的發生、發展分子機制對臨床探究特異性的分子診斷物尤為重要。

LncRNA是一類長度超過200個核苷酸的小分子非編碼RNA，參與腫瘤的發生、發展過程[9]。LncRNA MIR4435-1HG是近年來發現的一種非編碼RNA，在多種腫瘤中發揮調控作用。研究[10]表明，LncRNA MIR4435-1HG在腎癌中表達升高，其高表達與TNM分期、腫瘤大小和Fuhrman等級及患者預后密切相關，敲低其表達可抑制腎癌細胞增殖、遷移和侵襲。LncRNA MIR4435-1HG在口腔癌組織中表達上調，其高表達的患者總生存期和無復發生存期相對較短[11]。但目前，LncRNA MIR4435-1HG對胃癌發生、發展的影響還未知。本研究顯示，LncRNA MIR4435-1HG在胃癌細胞系中的表達量明顯上調，進一步下調LncRNA MIR4435-1HG的表達量發現，降低LncRNA MIR4435-1HG的水平抑制了胃癌AGS細胞增殖、侵襲和遷移，且誘導其凋亡，提示LncRNA MIR4435-1HG在胃癌中也發揮促癌基因作用，促進胃癌的發展進程，其可能是胃癌治療的潛在分子靶點。

LncRNA可作為競爭性內源性RNA與miRNA靶向結合，調控其靶基因的表達，進而影響疾病的發展進程[12-13]。miRNA也是一類廣泛存在于真核生物中的小分子非編碼RNA，其長度為18～25個核苷酸，在腫瘤的病理進程中發揮重要調節作用[14-16]。miR-150-5p在骨肉瘤[17]、肺鱗癌[18]、膠質瘤[19]、結腸癌[20]和黑色素瘤[21]等多種腫瘤組織中表達下調，上調其表達抑制了腫瘤細胞的增殖、侵襲等惡性行為；而在乳腺癌[22]、宮頸癌[23]等腫瘤中表達升高，發揮促癌基因作用。為進一步探究LncRNA MIR4435-1HG調節胃癌細胞增殖、侵襲的作用機制，本實驗通過在線數據庫預測LncRNA MIR4435-1HG的下游靶miRNA結果顯示，miR-150-5p可能是LncRNA MIR4435-1HG的靶基因，進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗證實了這一結果，提示LncRNA MIR4435-1HG可能通過靶向調控miR-150-5p促進AGS細胞增殖、侵襲、遷移。當然，本研究尚存在一些不足，如缺乏動物模型、臨床樣本等研究數據以及LncRNA MIR4435-1HG靶向調節miR-150-5p的分子機制尚不十分清楚，均需進一步深入研究。

4 結論

LncRNA MIR4435-1HG在多種胃癌細胞系中表達量上調；下調LncRNA MIR4435-1HG抑制AGS細胞增殖、侵襲、遷移，誘導凋亡，可能通過靶向調控miR-150-5p發揮作用，為胃癌的早期診斷、治療提供了基礎實驗。