桃紅四物湯調(diào)控NF-κB/TGF-β1/Smad通路抑制宮腔粘連的機(jī)制*

趙芳芳 遲博 李大海 馮君桃

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣西 南寧 530021)

宮腔粘連(Intrauterine adhesions，IUA)是由于子宮內(nèi)膜損傷、纖維化，最終導(dǎo)致宮腔閉塞的婦科常見病，多因人工流產(chǎn)術(shù)、宮腔手術(shù)及感染引起，目前臨床治療主要以宮腔鏡分離術(shù)、物理屏障放置、激素周期治療及中藥方劑治療等方法為主[1]。桃紅四物湯為中醫(yī)調(diào)經(jīng)名方，能有效改善婦科各類疾病。臨床研究表明，桃紅四物湯對宮腔粘連具有良好的療效[2]，但其對IUA的作用機(jī)制尚未闡明。NF-κB/TGF-β1/Smad通路介導(dǎo)的子宮內(nèi)膜纖維化是IUA重要的發(fā)病機(jī)制[3-4]。本研究擬選取IUA大鼠模型為研究對象，予以桃紅四物湯高、中、低劑量進(jìn)行治療，基于NF-κB/TGF-β1/Smad通路探討桃紅四物湯治療IUA的作用機(jī)制，旨在為IUA的防治提供新的思路和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 8～10周齡的雌性SD大鼠購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，SPF級，體質(zhì)量250～280 g，共50只，生產(chǎn)許可證號：SCXK(桂)2014-0002。桃紅四物湯(桃仁、當(dāng)歸、白芍各9 g，紅花、川芎各6 g，熟地黃12 g)飲片由我院藥劑科提供，參照文獻(xiàn)[5-6]將飲片用75%乙醇提取濃縮至生藥含量為2 g/mL提取液。本研究按照動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 實驗主要試劑及儀器 瓊脂糖(Solarbio A8201-10g)、TRIzol Reagent(Invitrogen，15596026)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，RR047a)、SYBR Green qPCRMix(Monad，MQ10301)、BCA蛋白定量試劑盒(Solarbio PC0020)、ECL化學(xué)發(fā)光底物(超敏)(Biosharp BL523A)、Anti-α-SMA一抗(abcam, ab32575)、Anti- Col Ⅰ一抗(abcam, ab34710)、Anti-FN一抗(abcam, ab34710)、Anti-NF-κB一抗(CST 8242)、Anti-p-NF-κB一抗(Santa Cruz sc-136548)、Anti- TGF-β1一抗(abcam, ab92486) 、Anti-p-Smad2一抗(abcam, ab53100)、Anti-Smad2一抗(abcam, ab33875)、Anti-p-Smad3一抗(abcam, ab52903) 、Anti-Smad3一抗(abcam, ab40854)、Anti-Smad7一抗(Santa Cruz sc-101152)、Anti-p-SMAD7一抗(Bioss antibodies, bs-20024R)、 Anti-β-actin一抗(abcam, ab8227)、山羊抗鼠二抗(Sigma A9309)、山羊抗兔二抗(Sigma A9169)、Rat TNF-α ELISA Kit(Elabscience E-EL-R2856c)、Rat IL-18 ELISA Kit(Elabscience E-EL-R0567c)、Rat IL-6 ELISA Kit(Elabscience E-EL-R0015c)、實時熒光定量PCR儀(Agilent Technologies，G8830-64001)、多功能酶標(biāo)儀(美國MD FilterMax F3)、電泳轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad PowerPac Basic)、凝膠成像系統(tǒng)(上海天能Tanon 5200)、NanoReady超微量紫外可見分光光度計(杭州遂真生物FC-1100)。

1.3 IUA模型建立 為避免不同月經(jīng)周期體內(nèi)雌孕激素水平變化對檢測結(jié)果的影響，常規(guī)陰道涂片進(jìn)行觀察，于大鼠動情期進(jìn)行手術(shù)。參照文獻(xiàn)[7]，大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，無菌環(huán)境下切開大鼠下腹部，暴露子宮，于宮頸上方約5 mm處作縱行切口，自制大鼠宮腔刮勺經(jīng)切口對大鼠行刮宮術(shù)，待宮腔四壁出現(xiàn)粗糙感時停止刮宮。將浸泡于脂多糖溶液的棉線置入已行刮宮術(shù)的宮腔，在腹壁留一定長度棉線以便下一步取出棉線。生理鹽水沖洗腹腔后縫合大鼠腹壁。24 h后取出脂多糖棉線。

1.4 分組及給藥 行刮宮手術(shù)大鼠隨機(jī)分為5組，分別為IUA模型組、桃紅四物湯高、中和低劑量組，每組各10只；同時選取10只大鼠作為正常組，不進(jìn)行任何處理。大鼠于刮宮術(shù)后第一天予以桃紅四物湯提取液治療。桃紅四物湯高、中、低劑量組按18 g/kg、9 g/kg及4.5 g/kg給藥量進(jìn)行灌胃[8]。各組治療時長為4個生理周期，共24 d。治療完成后，收集各組大鼠子宮組織進(jìn)行實驗。

1.5 RT-qPCR檢測各組子宮組織總RNA TRIzol法提取各組子宮組織總RNA。紫外分光光度計測定RNA的純度及濃度后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。設(shè)計并合成目的基因引物，見表1。引物由上海吉瑪生物有限公司合成。加入SYBR green Ⅰ染料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共45個循環(huán)。進(jìn)行溶解曲線檢測，按2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物序列

1.6 Western blot檢測子宮組織蛋白水平 取各組大鼠子宮組織冰浴裂解超聲勻漿提取蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，按照15 μg上樣量進(jìn)行樣品配平后，100℃金屬浴10 min，使蛋白變性。將蛋白樣品加入至SDS-PAGE凝膠中，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉等操作。以適宜濃度加入目的蛋白一抗于4℃過夜孵育。TBST洗滌，加入HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST洗凈后采用ECL法顯影，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。分析條帶灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參的比值。

1.7 ELISA檢測TNF-α、IL-18、IL-6濃度 取各組樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，每孔100 μL，依據(jù)TNF-α、IL-18、IL-6 ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀450 nm波長處以陰性對照孔調(diào)零，檢測各孔光密度值(OD)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組TNF-α、IL-18、IL-6的濃度。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯對IUA大鼠子宮組織纖維化標(biāo)志物的影響 與對照組比較，IUA模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中α-SMA、Col Ⅰ、FN mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與IUA模型組比較，桃紅四物湯組可顯著下調(diào)大鼠子宮組織中α-SMA、Col Ⅰ、FN mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05)，且中、高劑量組效果更顯著(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組α-SMA、Col Ⅰ、FN的表達(dá)水平(n=10)

2.2 桃紅四物湯對IUA大鼠子宮組織炎癥反應(yīng)的影響 與對照組比較，IUA模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中TNF-α、IL-18、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.05)；與IUA模型組比較，桃紅四物湯組可顯著下調(diào)大鼠子宮組織中TNF-α、IL-18、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05)，且中、高劑量組效果更顯著(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 各組TNF-α、IL-18、IL-6的蛋白表達(dá)水平

圖2 各組TNF-α、IL-18、IL-6 mRNA的表達(dá)(n=10)

2.3 桃紅四物湯對NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路的影響 采用Western blot檢測各組大鼠子宮組織NF-κB/轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，與對照組比較，IUA模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織中p-NF-κB、NF-κB、TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3的表達(dá)均顯著升高，p-Smad7、Smad7表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與IUA模型組比較，桃紅四物湯組可顯著下調(diào)大鼠子宮組織中p-NF-κB、NF-κB、TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3的表達(dá)，上調(diào)p-Smad7、Smad7表達(dá)(P<0.05)，且中、高劑量組效果更顯著(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)蛋白的Western blot檢測結(jié)果(n=10)

3 討論

IUA形成主要因刮宮等宮腔機(jī)械操作損傷及宮腔炎癥感染所致，由此造成過度炎癥反應(yīng)，子宮內(nèi)膜受損，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白和細(xì)胞因子分泌異常，膠原蛋白沉積在內(nèi)膜而致其纖維化，最終導(dǎo)致粘連發(fā)生[9]。α-SMA、Col Ⅰ、FN是ECM的重要組成部分，可用于判斷纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展[10-12]，并在IUA患者粘連組織中高度表達(dá)[13]。纖維化進(jìn)展又受炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，TNF-α、IL-18及IL-6是機(jī)體主要的促炎因子，可抑制ECM的降解，促進(jìn)子宮內(nèi)膜纖維化。研究指出，TNF-α、IL-18及IL-6在IUA患者子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)上調(diào)，且與IUA程度成正相關(guān)[14]，表明α-SMA、Col Ⅰ、FN、TNF-α、IL-18及IL-6水平均可作為IUA子宮纖維化及炎癥反應(yīng)的判斷指標(biāo)。本研究通過刮宮及感染雙重?fù)p傷建立IUA大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IUA大鼠子宮組織中α-SMA、Col Ⅰ、FN、TNF-α、IL-18及IL-6的表達(dá)明顯高于正常大鼠，與IUA發(fā)生發(fā)展機(jī)制一致，證實IUA模型造模成功，表明抗纖維化及抗炎是阻斷IUA進(jìn)展的關(guān)鍵策略。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，IUA屬“閉經(jīng)”“月經(jīng)過少”“通經(jīng)”的范疇；病因病機(jī)為先天稟賦不足，受器械傷，使腎氣損傷，外邪入里而濕熱下注，淤血停滯，治療當(dāng)以溫腎陽，祛濕熱補(bǔ)氣血為主[15]。桃紅四物湯為四物湯改良方，有補(bǔ)血養(yǎng)血，活血化瘀之效，是治療婦人氣(血)虛瘀血內(nèi)阻之證，祛瘀生新的代表方[16]。臨床研究表明，桃紅四物湯在治療輕中度IUA患者方面有效率達(dá)91%以上[17]。中醫(yī)“濕熱瘀結(jié)證”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“炎癥”及“纖維化”理論相關(guān)聯(lián)。臨床研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯方對肝纖維化也具有良好的治療效果[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯可顯著降低IUA大鼠子宮組織中α-SMA、Col Ⅰ、FN、TNF-α、IL-18及IL-6的表達(dá)，表明桃紅四物湯可通過發(fā)揮抗纖維化和抗炎效應(yīng)進(jìn)而抑制IUA進(jìn)展。

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、氧化應(yīng)激等生物過程[19]。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，NF-κB磷酸化激活，入核啟動下游如TNF-α、IL-18、IL-6等炎癥因子合成，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[20-21]，并且NF-κB還可通過與TGF-β1啟動子位點結(jié)合，促進(jìn)TGF-β1表達(dá)[22]。TGF-β1又可與細(xì)胞膜特異性受體結(jié)合，誘導(dǎo)Smad2和Smad3磷酸化，再與Smad4結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物進(jìn)入胞核，調(diào)控ECM蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)纖維化[23]；而Smad7作為TGF-β1/Smad信號通路的抑制調(diào)節(jié)因子被下調(diào)，從而減少其與TGF-β1受體的結(jié)合，降低對Smad2和Smad3磷酸化的抑制作用，進(jìn)一步促進(jìn)IUA形成[24]。既往研究已證實IUA患者粘連組織中NF-κB、TGF-β1和Smad3上調(diào)，而Smad7下調(diào)[25]，提示NF-κB/TGF-β1/Smad通路激活可能促進(jìn)了IUA纖維化。本研究基于NF-κB/TGF-β1/Smad通路，進(jìn)一步研究桃紅四物湯治療IUA的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)IUA大鼠模型中NF-κB/TGF-β1/Smad通路被激活，與IUA子宮內(nèi)膜纖維化機(jī)制一致，而桃紅四物湯可顯著降低TGF-β1和NF-κB、Smad2、Smad3表達(dá)及活化，促進(jìn)Smad7活化，表明桃紅四物湯治療IUA的機(jī)制可能是通過抑制NF-κB/TGF-β1通路的激活進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化和抗炎效應(yīng)。

4 結(jié)論

桃紅四物湯可明顯抑制NF-κB/TGF-β1/Smad信號通路的激活，降低IUA大鼠子宮組織中α-SMA、Col Ⅰ、FN、TNF-α、IL-18及IL-6的表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化及抗炎效應(yīng)，表明抑制NF-κB/TGF-β1/Smad通路活化是桃紅四物湯治療IUA的重要機(jī)制，為桃紅四物湯的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。