油松枯梢病菌孢子萌發率測定方法探索

史丹陽，任曉婧，魏步飛，許子怡，孫玉琴，李會平，4

(1.河北農業大學林學院，河北 保定 071001；2.黑龍江生態工程職業學院，黑龍江 哈爾濱 150025；3.木蘭縣太平種子林林場，黑龍江 木蘭 151900;4.河北省城市森林健康技術創新中心，河北 保定 071001)

油松Pinustabuliformis為中國特有松科針葉常綠喬木，具有很強的抗寒抗旱能力，在我國多省均有分布，是我國北方地區非常重要的造林和綠化景觀樹種[1]。油松對山地植被恢復也起著十分重要的作用，具有生態服務功能[2]。

2004年首次在秦皇島市聯峰山發現油松枯梢病，病原菌為松球殼孢菌Sphaeropsissapinea[3]。該病原菌的分生孢子器為黑色球形，半埋生于松梢表皮層，分生孢子長橢圓形，單胞或多胞，淺棕色，著生在分生孢子器內[4]。在研究該病菌的越冬場所、侵入途徑、侵染過程，篩選化學防治和生物防治藥劑的過程中，孢子萌發試驗是一項非常重要的工作[5-6]。傳統方法是在獲得分生孢子器的基礎上，配制孢子懸浮液，采用懸滴法、水瓊脂表面萌發法、培養皿萌發法、瓊脂平板表面萌發法等測定孢子萌發率，這是一項非常繁瑣且復雜的工作[7]。而且，該病菌不易在人工培養基中產生分生孢子器，因此獲得純凈足量的分生孢子也是一項具有挑戰性的工作。前期研究發現可以在滅菌松針上快速誘導出大量分生孢子器[8]，這些分生孢子器在適宜條件下即開始萌發產生菌絲。因此筆者探索以分生孢子器萌發率代替孢子萌發率的可能及兩者之間的關系，以期為油松枯梢病分生孢子萌發率的測定提供一種快速、便捷的方法。

1 材料與方法

1.1試驗材料 油松枯梢病菌Sphaeropsissapinea分離自秦皇島聯峰山的油松枯梢病株病梢，由河北農業大學林學院林木病理實驗室提供。分生孢子器誘導用松針，采自秦皇島聯峰山公園生長健壯的2 a生油松。

1.2試驗方法

1.2.1分生孢子器誘導和孢子懸浮液制備 將松針用自來水沖洗后，自然風干，切成約1 cm的小段，置于培養皿中，加少量蒸餾水以保持其濕潤，121 ℃高壓滅菌25 min，連續高壓滅菌3次，供試菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上生長3 d后，接種滅菌松針；在25 ℃恒溫光照培養箱內培養，待松針的分生孢子器和分生孢子成熟后取出，放置在無菌培養皿中備用。

用接種針將松針上的分生孢子器輕輕挑下，無菌水浸泡10 min后取出，使分生孢子完全釋放于無菌水中，配成濃度為1×106個/mL孢子懸浮液。

1.2.2懸滴法測定分生孢子萌發率 將孢子懸浮液滴于蓋玻片上，翻轉平放于凹玻片凹槽上，置于大培養皿中，用棉球蘸無菌水保濕。25 ℃恒溫光照培養2～50 h，每隔2 h觀察1次孢子萌發率。每次觀察5個載玻片作為重復，每個載玻片觀察5個視野，每次觀察500～800個孢子。芽管長度超過孢子直徑長度(指直徑最小的一邊)的一半，視為已經萌發。

分生孢子萌發率(%)=萌發的孢子數/孢子總數×100

1.2.3分生孢子器萌發率測定 將至少有80個分生孢子器的油松松針用無菌水沖洗后，0.1%的升汞表面消毒30 s，滅菌水沖洗3次，置于鋪有3層滅菌濕濾紙的培養皿中，LRH-250-G光照培養箱中25 ℃恒溫保濕培養2～50 h，每隔2 h光學顯微鏡下觀察其萌發情況，每次觀察5個油松松針。有菌絲自分生孢子器周圍伸出，長度超過分生孢子器直徑的一半，視為已經萌發。

分生孢子器萌發率(%)=產生菌絲的分生孢子器/分生孢子器總數×100

1.3數據分析 利用一元線性回歸分析，用SPSS軟件對分生孢子器萌發率和孢子萌發率進行線性回歸分析。

2 結果與分析

2.1分生孢子器誘導結果 滅菌油松松針接種于PDA培養基上15 d后開始出現黑色的突起，即分生孢子器(圖1)。分生孢子器直徑為0.5～1.4 mm，黑色球形，半埋生在松針表皮層，后突出外露。

圖1 油松枯梢病菌分生孢子器Fig.1 Pycnidia of S.sapinea

2.2分生孢子萌發過程 懸滴法測定的分生孢子萌發過程如圖2所示。分生孢子在處理2 h后開始萌發，長出芽管；隨著時間的延長，芽管的長度逐漸增加。孢子萌發率隨著時間的增長逐漸升高，2 h時孢子萌發率為22.3%，10 h時為34.4%，20 h時為55.3%，40 h時為78.2%，50 h時孢子萌發率趨于穩定，達84.3%(表1)。

A.未萌發Not germination；B.萌發2 h Germinated for 2 hours；C.萌發6 h Germinated for 6 hours；D.萌發8 h Germinated for 8 hours

2.3分生孢子器萌發過程 生有分生孢子器的松針保濕培養后，逐漸在分生孢子器的周圍觀察到菌絲體(圖3)。

處理后2 h，分生孢子器開始萌發，周圍可觀察到少量菌絲，萌發率為3.9%，隨著時間的延長，菌絲逐漸增多、長度增加，萌發率逐漸增高，20 h時為39.0%，40 h為64.1%，到50 h時萌發率趨于穩定，達80.0%(表1)。

表1 不同時間的分生孢子和分生孢子器萌發率Tab.1 Germination rate of conidia and pycnidia at different time

A.未萌發Not germination；B.萌發2 h Germinated for 2 hours；C.萌發6 h Germinated for 6 hours；D.萌發10 h Germinated for 10 hours

2.4分生孢子萌發率與分生孢子器萌發率的關系 分生孢子器萌發率和孢子萌發率之間具有線性關系，可用一元回歸方程y=0.195+0.864x表示，其中y為孢子萌發率，0.195為回歸截距，0.864為回歸系數(即傾向趨勢)，x為分生孢子器萌發率，分生孢子的萌發率和分生孢子器萌發率之間的線性關系較好(圖4)。

方差分析表明，分生孢子器萌發率與孢子萌發率之間具有線性關系(df=23，F=1 113.559，P=0<0.05)。

圖4 分生孢子萌發率與分生孢子器萌發率之間的一元線性回歸Fig.4 One variable linear regression of the relationship between conidia germination rate and pycnidia germination rate

利用回歸方程y=0.195+0.864x，對分生孢子的萌發率進行預測，預測值和實際值見表2。

可以看出利用該方程對分生孢子萌發率進行預測時，預測值和實際值誤差較小，可以用于實際孢子萌發率測定研究中(表2)。

表2 分生孢子萌發率預測值和實際值比較Tab.2 Comparison between predicted and actual values of conidia germination rate

3 結論與討論

本研究中采用了分生孢子器萌發法和一元線性回歸分析，通過用SPSS軟件對油松枯梢病分生孢子器萌發率和孢子萌發率進行線性回歸分析。分生孢子器萌發率和孢子萌發率之間具有線性關系，兩者的比值圍繞一定值波動，可以近似地用一元回歸方程表示。利用該回歸方程測算油松枯梢病分生孢子萌發率，方法簡便，可以作為孢子萌發率測定的代用方法。對于其他可以產生子實體的病原真菌孢子萌發率的測定，也可以借鑒此方法，但由于不同真菌的萌發要求和萌發過程不同，其回歸方程需要單獨摸索。