微紅梢斑螟誘導馬尾松揮發物成分變化及其行為反應

謝云忠，王國偉，劉江橋，徐芳玲

(貴州大學林學院，貴州 貴陽 550025)

微紅梢斑螟DioryctriarubellaHampson隸屬于屬鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae斑螟亞科Phycitinae梢斑螟屬Dioryctria[1]。在國內大多數省市有分布；國外主要分布于歐洲，俄羅斯、日本、朝鮮等。寄主主要有馬尾松Pinusmassoniana、黑松P.thunbergii、火炬松P.taeda等18種針葉樹種[2]。微紅梢斑螟為梢果兼害型害蟲，因其主要蛀食幼樹主梢和側梢，往往引起樹木偏冠和多頭現象，嚴重影響松樹生長勢、干型和出材量[3]。幼蟲可蛀食成熟林球果，影響到松樹種子產量以及天然更新速度。近年來，微紅梢斑螟已逐步上升成為我國南方地區松樹重要害蟲之一，如2009年湖南微紅梢斑螟嚴重暴發，危害面積達17.7萬hm2[4]。

針葉樹不同組織產生的揮發性物質組成不同，且某些組織具有特異性成分，這些特異性成分為昆蟲在寄主上定向活動(產卵、逃避和取食等)發揮著引導作用[5-7]。植物揮發物隨著害蟲取食，其部分成分和含量會發生變化，并對昆蟲表現出引誘或者趨避作用。有研究表明二化螟Chilosuppressalis取食為害水稻后，誘導水稻植株產生的揮發物顯著驅避二化螟成蟲產卵[8]，但是趨性產卵于褐飛虱NilaparvatalugensSt?l為害或者褐飛虱和二化螟共同為害的水稻植株[9]。李新崗 等研究發現松果梢斑螟DioryctriamendacellaStaudinger選擇蟲害油松Pinustabuliformis球果而不選擇健康油松球果[10]。為了明確其中的選擇原因，楊立軍對蟲害油松果和健康油松果揮發物成分進行對比分析，發現蟲害球果所釋放的揮發物組分和含量發生了較大的變化，其中變化比較明顯的組分有α-蒎烯、β-蒎烯、β-香葉烯等，且松果梢斑螟對β-香葉烯、D-檸檬烯、α-蒎烯等具有顯著的觸角電位(EAG)反應[11]。說明球果揮發物主要成分和含量對松果梢斑螟具有明顯引誘作用。美國南方松梢斑螟Dioryctriaamatella明顯趨向于在東南球果銹病菌Cronartiumstrobilinum為害的2 a生球果上產卵，寄主引誘成分為α-蒎烯、香葉烯和檸檬烯[12-14]。因此，蟲害誘導植物揮發物的種類和含量等均是調控植食性昆蟲取食和產卵行為的關鍵因素之一。筆者分析微紅梢斑螟取食誘導后的馬尾松松果和松梢揮發物變化，觀察其嗅覺行為反應，以期為后續微紅梢斑螟監測和引誘劑的研發提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1供試蟲源 微紅梢斑螟幼蟲均采自貴州省都勻市馬鞍山馬尾松國家林木良種基地和貴州省凱里市黃平縣國有林場。采集后，人工飼養于透明保鮮盒中，以新鮮松梢為食料，每7 d更換食料，每天對食料表面噴霧保濕，置于人工氣候箱(溫度26 ℃、相對濕度60%、光周期14 L∶10 D)中飼養。

1.2松梢和松果浸提液的制備 稱取微紅梢斑螟蟲害松梢和健康松梢各20 g，蟲害松果和健康松果各45 g，松梢用20 mL正己烷，松果用45 mL正己烷浸提24 h，過濾后置于-18 ℃下保存備用[15-16]。

1.3揮發物的收集與鑒定 在都勻市馬鞍山馬尾松國家林木良種基地采用動態頂空吸附法對馬尾松揮發物進行活體采集。采集時將蟲害和健康松梢、松果分別套入微波爐專用袋(Oven bags，25 cm×38 cm，美國Reynolds公司)中密封。收集前先排凈袋內空氣，然后通入經過活性炭過濾過的干燥空氣，待袋內充滿空氣為止。QC-1S大氣采樣儀(北京市勞動保護科學研究院)進氣口和出氣口分別連接活性炭管和吸附管(填充有Porapak Q吸附劑，80～100目，北京康林科技有限責任公司)，其余用硅膠管相連，并在接口處用封口膜封住，避免漏氣。大氣采樣儀的流速設定為0.5 L/min，采集時間為6 h，試驗重復5次。收集完成后立即用封口膜將吸附管兩側封堵，帶回實驗室用2 mL正己烷洗脫，置于-18 ℃冰箱保存待分析。

采用HP6890/5975C GC/MS聯用儀(美國安捷倫公司)對揮發物洗脫液進行分析。色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升溫至220 ℃，保持19 min，運行時間66 min；汽化室溫度230 ℃；載氣為高純He(99.999%)；載氣流量1.0 mL/min；分流進樣，分流比10∶1；溶劑延遲時間3 min。離子源為EI源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，發射電流34.6 μA，倍增器電壓1 776 V，接口溫度240 ℃，質量范圍29～500 amu。

1.4微紅梢斑螟對梢果4種浸提液的嗅覺行為反應 采用“Y”形嗅覺儀(直臂長20 cm，兩側臂長15 cm，內徑4 cm)測試微紅梢斑螟對蟲害和健康松梢、松果4種浸提液的嗅覺行為反應。測試前于味源瓶中滴入30 μL待測浸提液，以正己烷為對照，氣流速率調節500 mL/min。在主臂一端放入1頭微紅梢斑螟成蟲，每頭成蟲連續觀察5 min，若進入任意一壁內并停留1 min以上則看作其做出有效選擇，若停留在主壁內則記為無反應。每5頭成蟲為1組，共重復10組，每組測完之后調換味源瓶和對照瓶的位置，并用95%乙醇清潔嗅覺儀，熱風干燥后待用。

1.5數據分析 利用Nist17和Wiley275標準質譜圖鑒別揮發物成分，峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質量分數。使用IBM SPSS Statistics 22卡方檢驗微紅梢斑螟成蟲對蟲害梢果和健康梢果浸提液之間是否呈假設H0為50%∶50%的理論分布，計算卡方值和顯著性水平[17]。使用Origin 2019繪制圖形。

2 結果與分析

2.1微紅梢斑螟誘導馬尾松揮發物的變化 松梢中共獲得10類化合物。其中，健康松梢中共獲得53種揮發性化合物，萜類化合物16種，占比最大，其次是烴類化合物17種和酮類化合物5種；蟲害松梢中共獲得58種化合物，其中萜類化合物19種，其次是烴類化合物16種和醇類化合物7種；蟲害松梢所獲的化合物數量比健康松梢多5種。從揮發物類別的相對含量變化上看，蟲害松梢相比健康松梢，萜類化合物顯著上調(F=10.116，P=0.013)，醇類、酚類、酯類、酰胺類化合物顯著下調(F醇=7.635，P醇=0.025；F酚=26.708，P酚=0.007；F酯=11.230，P酯=0.029；F酰胺=17.526，P酰胺=0.003)，其他化合物雖呈現下調，但是不存在顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 受害與健康馬尾松松梢各揮發物含量比較Fig.1 Comparison of volatile content from healthy and infested shoots of P. massoniana

松果中獲得9類化合物。健康松果中獲得59種揮發物，其中萜類化合物19種，占比最大，其次是烴類16種和醇類6種；蟲害果中獲得57種揮發物，萜類化合物22種，烴類化合物16種，醇類化合物7種；蟲害松果化合物數量比健康松果少2種。從揮發物類別的相對含量變化上看，蟲害松果與健康松果相比，萜類化合物呈現明顯的上調(F=9.371，P=0.038)，醛類和酰胺類化合物呈現明顯的下調(F醛=17.785，P醛=0.014；F酰胺=9.022，P酰胺=0.017)，其他化合物不存在含量變化的顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 受害與健康馬尾松松果各揮發物含量比較Fig.2 Comparison of volatile content from healthy and infested cones of P. massoniana

蟲害梢、果的揮發物成分含量均發生變化，且都具有特異性成分。與健康梢相比，蟲害梢揮發物成分含量發生變化的有11種，其中具有顯著性差異變化的有6種(P<0.05)；蟲害梢產生10種特異性成分，包括α-葑烯、α-松油烯、β-石竹烯、萜品油烯、壬醛、龍腦烯醛、苯甲醛、L-薄荷醇、馬鞭草烯醇和4-(1-甲基乙基)-2-環己烯-1-酮(表1)。松果揮發物中，蟲害果的特異性成分有7種，包括α-葑烯、2 -蒈烯、(+)-苜蓿烯、α-律草烯、2,6,10-三甲基十三烷、對乙基苯乙酮、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇；其揮發物成分含量發生變化的化合物有11種，但是具有顯著性變化的只有5種(P<0.05)，包括α-蒎烯、檸檬烯、β-水芹烯、萜品油烯、松香芹酮(表2)。

表1 微紅梢斑螟誘導馬尾松松梢揮發物成分相對含量的變化Tab.1 Changes of the relative contents of volatile components in P. massoniana shoots induced by Dioryctria rubella

續表1 Tab.1(Continued)

注：表中數據為平均值±標準差，“—”表示未檢測到該化合物，同行不同小寫字母表示表示受害梢和健康梢間含量差異顯著(P<0.05)。
Note:Data in the table are mean ± SD,the dash (—)indicates that the compound was undetected,different lowercase letters in the same row indicate significant differences of content between infested and healthy pine shoots (P<0.05).

表2 微紅梢斑螟誘導馬尾松松果揮發物成分相對含量的變化Tab.2 Changes of the relative contents of volatile components in P. massoniana cone induced by D. rubella

注：表中數據為平均值±標準差，“—”表示未檢測到該化合物，同行不同小寫字母表示受害和健康松果間含量差異顯著(P<0.05)。
Note:Data in the table are mean ± SD,the dash (—)indicates that the compound was undetected,different lowercase letters in the same row indicate significant differences of content between infested and healthy cones (P<0.05).

2.2微紅梢斑螟對松梢及松果浸提液的嗅覺行為反應 微紅梢斑螟嗅覺行為反應如圖3所示。微紅梢斑螟成蟲對蟲害梢浸提液的選擇率可達到60%，極顯著高于健康梢浸提液的(P<0.01)；其對蟲害果浸提液的選擇率與健康果浸提液的相近，且差異不顯著。與對照正己烷對比，微紅梢斑螟均顯著選擇松梢和松果的浸提液(P<0.05)，其中對蟲害梢浸提液的選擇率可達到70%，且差異極顯著(P<0.001)，對蟲害果浸提液的選擇率達到56%，差異顯著(P<0.05)。

ns，差異不顯著no significant difference(P>0.05)；*，差異顯著significant difference(P<0.05)；**,差異極顯著extremely significant difference(P<0.01)

3 結論與討論

通過對馬尾松蟲害和健康松梢及松果的揮發物定性、定量分析發現，其揮發物成分含量發生明顯的變化。蟲害松梢與健康松梢相比，萜類和醛類化合物含量呈現上調，腈類無明顯變化，其他化合物含量均下調，并且產生了10種特異性成分。蟲害松果與健康松果相比，只有萜類化合物含量呈現上調，其他類別化合物含量均呈現下調或者無明顯變化，產生7種特異性成分。

微紅梢斑螟成蟲對蟲害松梢和松果浸提液具有顯著的選擇趨性，且對蟲害松梢的選擇趨性更強。結合馬尾松蟲害和健康梢、果揮發物成分及含量分析，微紅梢斑螟危害后的馬尾松松梢和松果中揮發物成分的組成、含量的變化與其對寄主的選擇具有相關性。

在已有的研究中，馬尾松揮發物成分主要為萜烯類化合物[18-20]，其中含量較高的成分為α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯和β-水芹烯等，這幾種化合物的相對含量能達到揮發物總含量的80%以上。部分研究顯示蟲害誘導后馬尾松揮發物中α-蒎烯的含量顯著降低[18,21]，但在本研究中，微紅梢斑螟危害后α-蒎烯含量卻顯著升高，這可能受揮發物的采集部位和害蟲為害方式的影響。松果梢斑螟成蟲產卵期，受害和健康球果揮發物組分變化明顯，釋放的揮發物成分含量差異顯著[22]。蟲害球果與健康球果相比，蟲害球果所釋放的揮發物組分和含量發生了較大的變化，且能引起強烈的EAG反應[23]。赤松梢斑螟Dioryctriasylvestrella更偏好取食受機械損傷的海岸松Pinuspinaster，表明機械損傷后產生的特異性成分芳樟醇是起引導作用的關鍵成分之一[24]。在本研究中，微紅梢斑螟更傾向選擇蟲害馬尾松，同其它梢斑螟類害蟲存在相似性。α-蒎烯在南方松果梢斑螟的產卵位置識別中起著重要作用[12,25]；微紅梢斑螟主要產卵于被害枝梢和被害球果上[2,26]，表明蟲害后的松梢和松果不但對微紅梢斑螟成蟲具有引誘作用，也可能含有吸引成蟲產卵的揮發性化合物。因此，在后續的研究中，重點在于篩選出對微紅梢斑螟具有引誘作用和吸引產卵作用的揮發物成分，以期為后續引誘劑的研發奠定基礎。