過濾對超速離心法提取外泌體的影響

李 榕 陳 靜 李傳云 周 童 陳 歡 陳德喜 喬躍兵* 李偉華*

(1. 承德醫學院人體解剖與組織胚胎學教研室，河北承德 067000; 2. 首都醫科大學附屬北京佑安醫院肝病研究所，北京 100069; 3. 首都醫科大學附屬北京佑安醫院外科中心，北京 100069; 4. 中南大學湘雅公共衛生學院，長沙 410078)

外泌體(exosome) 是由細胞分泌的膜性小囊泡，直徑30～150 nm[1]。外泌體包含有蛋白質、RNA和DNA等多種成分[2-3]，在細胞信號傳遞、細胞遷移、血管新生、免疫反應和腫瘤細胞生長等方面具有重要的作用[4-7]。由于外泌體是納米級的顆粒，非常小，目前仍沒有特異的分離純化方法。超速離心法作為外泌體提取的“金標準”是最常用的提取和純化手段[8]。有研究[9-10]報道在超速離心提取外泌體時，先用0.22 μm濾器過濾，認為這樣可以去除標本中的大分子物質，容易獲取外泌體。但過濾對外泌體的提取數量有何影響？是否提高了外泌體的純度？相關報道較少。本實驗通過納米顆粒追蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)方法和Amnis量化成像流式檢測外泌體特異性抗體CD9、CD63的方法，檢測過濾前后外泌體的數量及在總顆粒中的百分比，分析經0.22 μm濾膜過濾對超速離心法提取外泌體數量及純度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI-1640培養基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、0.25%(質量分數)胰蛋白酶(trypsin-EDTA)、5 U/mL 青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin solution)和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)均購自美國 Gibco公司；肺癌PC-9/IR細胞 (南京科佰生物科技有限公司)；FITC-CD9和PE-CD63抗體購自美國 BD公司；0.22 μm濾器(美國 Millipore公司)；Amnis量化成像流式分析儀(法國 Millipore公司)；超速離心機和超濾管(美國 Beckman Coulter公司，Optima XPN-100)；超敏激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司,TCS-STED-3X)；納米顆粒跟蹤分析儀(德國 Particle Metrix公司,ZetaView)；透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司,Hitachi-7650)；納米流式檢測儀(廈門福流生物科技有限公司,NanoFCM)。

1.2 方法

1.2.1 血漿標本留取

收集2020年10月至12月首都醫科大學附屬北京佑安醫院健康查體樣本6例，每例樣本留取全血10 mL。本研究經過首都醫科大學附屬北京佑安醫院倫理委員會批準，批準文號：京佑科倫理[2021]034號。所有志愿者均簽署知情同意書。

1.2.2 PC-9/IR細胞培養

PC-9/IR細胞是人肺癌細胞，易培養，可分泌大量外泌體，因此本實驗選用此細胞上清的外泌體作為研究對象。含1%(質量分數)青霉素-鏈霉素和10%(體積分數)FBS的RPMI-1640培養基于37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養PC-9/IR細胞，0.25%(質量分數)胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3 血漿外泌體的提取

取全血10 mL，300g離心10 min，去除細胞；取上清，1 000g離心10 min，去除死細胞；取上清，4 ℃ 2 000g離心30 min，去除細胞碎片；取上清， 4 ℃ 10 000g離心30 min，去除凋亡小體等較大的囊泡；取上清，置于SW32Ti貝克曼超速離心管中，加入適量PBS，4 ℃ 110 000g離心70 min；重復上一步；棄上清，外泌體(沉淀)重懸于400 μL PBS中備用。

1.2.4 培養上清外泌體的提取

PC-9/IR細胞培養上清外泌體提取方法同血漿外泌體的提取方法。

1.2.5 外泌體過濾

收集好的外泌體，平均分為2組，過濾組(fitration group, GL)使用0.22 μm 濾器將外泌體過濾后進行NTA和Amnis量化成像流式檢測，未過濾組(unfiltration group,NC)直接進行NTA和Amnis量化成像流式檢測。

1.2.6 納米顆粒追蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)

用PBS調節外泌體至1×107粒/mL～1×109粒/mL，納米顆粒跟蹤分析儀采用激光照射外泌體懸浮液，并對外泌體顆粒的散射光進行檢測，通過統計散射顆粒的數量來計算納米顆粒濃度。同時，追蹤納米顆粒布朗運動的軌跡，計算出單位時間納米顆粒的均方位移(mean squared displacement,MSD)，并根據結果得出納米顆粒粒徑分布圖。

1.2.7 外泌體抗體染色

將過濾后的外泌體平均分配到2個1.5 mL的EP管中，標記為GL-CD9組和GL-CD63組;未過濾的外泌體平均分配到2個1.5 mL EP管中，標記為NC-CD9 組和NC-CD63組。在兩組標記CD9和CD63的管中，分別加入10 μL FITC-CD9、 PE-CD63抗體。置于冰上，避光染色40 min。然后將其分別轉移至超離管中，加入PBS，4 ℃ 110 000g離心70 min，洗掉未結合的抗體。使用100 μL PBS重懸沉淀并轉至1.5 mL EP管中，避光，備用，實驗設計及技術流程見圖1。

圖1 技術流程圖Fig.1 Experimental technology programePBS: phosphate buffer solution; NC: unfiltration group; GL: filtration group.

1.2.8 Aminis量化成像流式分析

采用ImageStreamX軟件收集100 000個粒子。在量化成像流式分析系統上獲取數據，使用IDEAS?軟件統計分析CD9+Exo和CD63+Exo的數量及CD9+Exo和CD63+Exo在總粒子中的百分比。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 外泌體的鑒定

透射電鏡觀察到外泌體的形態和結構(圖2),超敏激光共聚焦顯微鏡觀察到外泌體特異性標志物CD9-AF647標記的外泌體(圖3),納米流式檢測外泌體的平均粒徑為62 nm左右(圖4)。

圖2 外泌體電鏡圖片Fig.2 Exosomes picture of electron microscope(Scale bar=200 μm)

圖3 外泌體超敏激光共聚焦顯微鏡圖片(CD9-AF647)Fig.3 Exosomes picture of ultra-sensitive confocal laser microscope(CD9-AF647)

圖4 納米流式檢測外泌體Fig.4 Nanometer flow cytometer detection of exosomes

2.2 納米顆粒跟蹤分析檢測過濾組與未過濾組外泌體粒徑及數量的變化

NTA結果顯示，超速離心法提取納米粒徑主峰值集中在67～77 nm(表1，圖5A～D)，與外泌體體積(30～150 nm)大小相符。過濾前、后血漿外泌體粒徑分別為83.31 nm和80.74 nm，培養上清外泌體粒徑分別為94.11 nm和88.62 nm。2組外泌體粒徑過濾前、后差異無統計學意義(P>0.05)。血漿外泌體未過濾組數量為9.44×1010個/mL，過濾組為2.01×1010個/mL，相差約4.7倍(圖5E)。培養上清外泌體未過濾組數量為12.21×1010個/mL，過濾組為4.82×1010個/mL，相差約2.5倍(圖5F)。血漿及培養上清過濾組外泌體數量明顯下降，與未過濾組比較差異有統計學意義(P<0.01)。過濾對血漿外泌體的減少大于培養上清。

表1 NTA檢測血漿和培養上清中過濾組與未過濾組納米顆粒的粒徑及數量

圖5 NTA檢測過濾前后外泌體數量變化倍數Fig.5 Fold changes of exosomes before and after filtration by NTA detectedA: Exosome size distribution in plasma unfiltered group; B: Exosome size distribution in plasma filtration group; C: Exosome particle size distribution of culture supernatant unfiltered group; D: Exosome particle size distribution of culture supernatant filtration group; E: The ratio of the number of exosomes between the unfiltered group and the filtered group of plasma samples; F: The ratio of the number of exosomes in the culture supernatant between the unfiltration group and the filtration group. **P<0.01, ***P<0.001 vs Baseline; NC： unfiltration group; GL： filtration group; NTA: nanoparticle tracking analysis.

2.3 Amnis量化成像流式檢測過濾組與未過濾組外泌體數量及純度的變化

CD9和CD63是外泌體特異性標志，用FITC-CD9和PE-CD63單抗對外泌體進行標記， Amnis量化成像流式進行檢測，IDEAS?軟件統計CD9+Exo和CD63+Exo的數量及CD9+Exo和CD63+Exo在總粒子中的百分比(圖6)。

圖6 Amnis量化成像流式檢測CD9+和CD63+外泌體Fig.6 CD9+ and CD63+ exosomes determined by Amnis flow cytometry

Amnis量化成像流式結果顯示，血漿未過濾組CD9+Exo、CD63+Exo和總粒子的數量分別為(8.15±2.13)×106/mL、(3.62±0.71)×106/mL和(32.09±5.80)×106/mL，過濾組為(1.63±0.86)×106/mL、(1.39±0.44)×106/mL和(14.01±2.06)×106/mL，分別下降了5倍、2.6倍和2.3倍。培養上清未過濾組中CD9+Exo、CD63+Exo總粒子的數量分別為(3.23±0.70)×106/mL、(31.33±6.28)×106/mL和(121.10±22.70)×106/mL，過濾組為(1.01±0.21)×106/mL、(13.88±3.00)×106/mL和(60.60±10.86)×106/mL，分別下降了3倍、2.3倍和2倍，詳見表2。各過濾組與未過濾組相比差異均統計學意義(P<0.05) (圖7A、7B) 。以上數據顯示，過濾可以明顯降低外泌體提取的數量。

表2 Amnis量化成像檢測CD9+Exo和CD63+Exo的數量及百分比

血漿中未過濾組與過濾組CD9+Exo分別占總粒子數的21.23%和8.49%，CD63+Exo分別占總粒子數的14.77%和10.63%。培養上清中未過濾組與過濾組CD9+Exo分別占總粒子數的20.77%和7.99%，CD63+Exo分別占總粒子數的13.36%和13.07%。以上各過濾組與未過濾組相比除CD9+Exo明顯下降外(P<0.05)，CD63+Exo和總粒子組差異無統計學意義(P>0.05) (圖7C、7D)。以上數據顯示，過濾后，CD9+Exo和CD63+Exo在粒子中的百分比(外泌體的純度)并沒有提高反而有所下降。

圖7 過濾對外泌體數量及純度的影響Fig.7 Effects of filtration on the quantity and purity of exosomes A: The number of CD9+ Exo, CD63+ Exo and total particles between plasma filtration group and unfiltration group; B: The number of CD9+ Exo, CD63+ Exo and total particles between the filtered group and the unfiltered group; C: The percentage of CD9+ Exo, CD63+ Exo in total particles between plasma filtration group and unfiltration group; D: The percentage of CD9+ Exo, CD63+ Exo in the total particles between the filtered group and the unfiltered group. *P<0.05 vs NC group; NC： unfiltration group; GL： filtration group.

3 討論

外泌體已成為醫學和生命科學領域研究的熱點，獲得高純度的外泌體對后續研究至關重要。超速離心法是目前外泌體最常用和有效的提取方法[11]，由于外泌體體積極小，其提取的純度和生物活性很容易受到離心力、離心時間等外界因素的影響[12]，因而尋找與其相適應的提取方法是開展外泌體研究的前提。

外泌體體積約30～150 nm，理論上使用0.22 μm濾膜過濾對其數量不會產生明顯影響。本實驗數據顯示，使用0.22 μm過濾膜過濾后明顯降低了外泌體納米提取的數量，過濾組與未過濾組相比，外泌體數量下降了2～5倍。分析原因可能有以下2點：第一，外泌體在血漿和培養上清中可能黏附體積較大的大分子(如蛋白質或細胞碎片)，這些大分子在過濾過程中被清除，黏附在上面的外泌體也被清除。第二，文獻[13]報道，每毫升血漿中大概有109個外泌體，濃度非常大，在如此大濃度下，外泌體有可能彼此之間黏附聚集成團，這些團塊在過濾時被清除，因而降低了外泌體的數量。另外，本實驗數據顯示，過濾使血漿比培養上清中外泌體下降更多，這一結果從另一方面驗證了第二點推測的可能性。

為了明確過濾是否提高了外泌體的純度，筆者使用外泌體特異性抗體CD9和CD63對外泌體進行標記，使用Amnis量化成像流式[14-15]對標記的抗體進行檢測。Amnis量化成像流式MKII的激光功率高，靈敏度高，利用 Amnis 可以檢測到直徑 20 nm 微珠的熒光信號[16]，并可以拍攝到直徑為 100 nm 的微珠的圖像。 因此，Amnis 量化成像流式的靈敏度和圖像分辨率可以檢測直徑范圍在 30～100 nm 的外泌體。結果顯示，過濾組CD9+Exo、CD63+Exo以及總顆粒都有明顯下降，與NTA結果一致。進一步分析CD9+Exo和CD63+Exo在顆粒中的百分比并沒有提高，也就是說過濾并沒有提高外泌體的純度。其原因可能是使用0.22 μm濾器處理樣本后，外泌體聚集的團塊被過濾，CD9+Exo和CD63+Exo數量下降。CD9+Exo和CD63+Exo百分比也隨之下降，因此過濾并未提高外泌體的純度。

不管是基礎實驗研究還是臨床疾病診斷，獲取足夠數量、高純度的外泌體是研究其功能、內容物及作用機制的一個重要前提。雖然過濾會減少外泌體的獲取數量，但由于超速離心法在反復離心的過程中會導致外泌體污染，0.22 μm過濾膜可以去除細菌。如提取外泌體后，后繼實驗需要無菌操作(如用外泌體與細胞共培養等)，過濾仍是最好的選擇。因此，在外泌體提取過程中，可以根據實驗需求決定過濾和不過濾。