白藜蘆醇調(diào)控金屬蛋白酶9抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用及機(jī)制*

南文慶，范學(xué)鋒，宋 濤，王勤學(xué)，方彩霞，付衛(wèi)東

（甘肅省慶陽市人民醫(yī)院 1.藥劑科，2.腫瘤科，甘肅 745000）

宮頸癌是全世界女性中第四大最常見的惡性腫瘤，也是腫瘤相關(guān)死亡的第四大主要原因，僅在2018年就報告了約57萬例宮頸癌病例和31萬例死亡病例[1]。據(jù)估計，全世界宮頸癌死亡的85%左右發(fā)生在低收入和中等收入的發(fā)展中國家中，包括我國在內(nèi)，宮頸癌死亡率是發(fā)達(dá)國家的18 倍[2]。由于診斷和治療的進(jìn)步，早期宮頸癌患者的臨床結(jié)局得到了改善，而晚期和轉(zhuǎn)移性宮頸癌的預(yù)后仍然不盡人意[3]。研究報道天然化合物是抗宮頸癌晚期治療的潛在有效治療劑[4]。白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是一種天然的多酚化合物，其在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤中的抗腫瘤作用逐漸被報道[5-6]。研究顯示，RSV 通過抑制HPV E6 蛋白、STAT3 磷酸化、自噬信號通路等抑制宮頸癌的惡性進(jìn)展，但是RSV在宮頸癌發(fā)揮抗腫瘤的具體作用機(jī)制未完全明確[6-8]。金屬蛋白酶9(a disintegrin and metalloproteinase 9,ADAM9)屬于ADAM 家族，該家族與包括血管生成、細(xì)胞間相互作用和遷移等多種生物學(xué)過程相關(guān)[9]。ADAM9在宮頸癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后不良相關(guān)[10]。Lin 等[11]報道RSV 通過蛋白—蛋白酶體途徑抑制腫瘤細(xì)胞中ADAM9蛋白的表達(dá)以抑制肺癌和食管癌細(xì)胞遷移和生存能力。本研究通過探討RSV調(diào)控ADAM9抑制宮頸癌的惡性進(jìn)展，獲得RSV抗宮頸癌治療的新分子機(jī)制及ADAM9作為RSV潛在抗癌靶點的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

宮頸癌細(xì)胞系HeLa，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和FBS，購自北京清大天一生物技術(shù)有限公司；DMSO 和RSV 試劑購自美國sigma公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK8），購自英國Abcam公司；Transwell小室，購自美國Coring公司；活性氧ROS檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ADAM9敲減質(zhì)粒（sh-ADAM9）和ADAM9過表達(dá)質(zhì)粒（oe-ADAM9），由上海吉凱基因生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；高效蛋白裂解液，購自上海貝博生物科技公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑，購自美國Thermo公司；上樣緩沖液，購自上海碧云天試劑有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，購自北京索萊寶試劑公司；PVDF膜，購自美國Promega公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購自中國大連Meilunbio?飛克特試劑有限公司；ADAM9 和GAPDH 抗體，購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將宮頸癌細(xì)胞HeLa 培養(yǎng)在含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，并在5%CO2的37 ℃全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿時，棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗兩次后，加入胰酶消化細(xì)胞，終止消化后進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 CCK8檢測RSV對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

HeLa 細(xì)胞胰酶消化計數(shù)后，以每孔1 500 個細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，設(shè)置0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L 濃度RSV 的細(xì)胞，每個濃度設(shè)置6 個平行復(fù)孔。細(xì)胞接種10 h后，分別采用相應(yīng)濃度的RSV處理細(xì)胞。藥物處理48 h 后，更換100 μL 培養(yǎng)基和20 μL 的CCK8 試劑，混勻后在37 ℃全濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。采用酶標(biāo)儀450 nm檢測細(xì)胞吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率=（1-相應(yīng)濃度RSV平均細(xì)胞OD值/0濃度RSV平均細(xì)胞OD值）×100%。

1.4 細(xì)胞分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HeLa 細(xì)胞胰酶消化計數(shù)后，以每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，分為DMSO組和RSV組。細(xì)胞接種10 h時，采用20μmol/L的RSV處理RSV組，采用相對應(yīng)體積的DMSO處理DMSO組，放置培養(yǎng)箱中處理48 h。

HeLa 細(xì)胞胰酶消化計數(shù)后，以每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，分為RSV組、RSV+NC組、RSV+sh-ADAM9 組和RSV+oe-ADAM9 組。細(xì)胞接種10 h后，RSV組采用20μmol/L的RSV處理細(xì)胞，RSV+NC 組采用20μmol/L 的RSV 處理細(xì)胞并采用脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，RSV+sh-ADAM9 組采用20μmol/L的RSV處理細(xì)胞并采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染ADAM9敲減質(zhì)粒，RSV+oe-ADAM9組采用20μmol/L的RSV處理細(xì)胞并采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染ADAM9過表達(dá)質(zhì)粒。

1.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力

各組HeLa 細(xì)胞胰酶消化并洗滌細(xì)胞兩次后，計數(shù)，以1×106個細(xì)胞重懸至100μL 無血清培養(yǎng)基中，鋪在Transwell 小室的上腔室中的聚碳酸酯膜上。600μL 完全培養(yǎng)基（含有10%FBS）放入Transwell 小室的下室中，放至37 ℃全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。將穿過膜的細(xì)胞于甲醇溶液中固定10 min，吉姆薩染色30 min。采用顯微鏡計數(shù)細(xì)胞穿過的數(shù)目。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達(dá)

各組HeLa 細(xì)胞胰酶消化并洗滌細(xì)胞兩次后，加入高效蛋白裂解液。細(xì)胞裂解后4 ℃、14 000 r/min 離心30 min，獲得蛋白上清液。BCA 蛋白濃度檢測試劑檢測蛋白的濃度，水煮變性。50μg 等量蛋白加至SDS-PAGE 凝膠中80 V 電泳2 h 后，采用350 mA、1.5 h 將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。PVDF 膜與8%脫脂牛奶室溫孵育1 h，封閉非特異性抗原。TBST 洗3 次后，與ADAM9 一抗稀釋液（稀釋倍數(shù)1∶500）、GAPDH 一抗稀釋液（稀釋倍數(shù)1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗3 次后，與兔二抗稀釋液（稀釋倍數(shù)1∶10 000）常溫孵育1 h，TBST 搖床洗3 次后，采用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測ROS

各組HeLa 細(xì)胞棄掉舊培養(yǎng)基后，加入含有10μmol/L DCFH-DA 的無血清培養(yǎng)基放置37 ℃全濕度培養(yǎng)箱中孵育30 min進(jìn)行探針裝載。PBS洗3次后，采用流式細(xì)胞儀，在488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，獲得樣品熒光強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖

HeLa 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的RSV 處理48 h 后，CCK8結(jié)果顯示RSV呈濃度依賴性抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖能力，見圖1。

圖1 RSV對HeLa細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 RSV抑制宮頸癌細(xì)胞遷移能力

20 μmol/L 的RSV 處理宮頸癌細(xì)胞HeLa 48 h后，Transwell 小室實驗檢測結(jié)果顯示，DMSO 組穿膜細(xì)胞數(shù)為（74.33±16.09）個，RSV組穿膜細(xì)胞數(shù)為（30.67±3.79）個。與DMSO 組比較，RSV 組宮頸癌細(xì)胞遷移能力顯著降低(t=4.582,P=0.006)，見圖2。

圖2 RSV對HeLa細(xì)胞遷移能力的影響

2.3 RSV抑制宮頸癌細(xì)胞中ADAM9蛋白的表達(dá)

20 μmol/L 的RSV 處理宮頸癌細(xì)胞HeLa 48 h后，western blotting實驗檢測結(jié)果顯示，DMSO組細(xì)胞中ADAM9 蛋白的表達(dá)為0.98±0.09，RSV 組細(xì)胞中ADAM9蛋白的表達(dá)為0.13±0.04，與DMSO組相比，RSV 組宮頸癌細(xì)胞中ADAM9 蛋白的表達(dá)顯著降低(t=14.945,P=0.000)，見圖3。

圖3 RSV對HeLa細(xì)胞中ADAM9蛋白表達(dá)的影響

2.4 RSV抑制宮頸癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生

20 μmol/L 的RSV 處理宮頸癌細(xì)胞HeLa 48 h后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，DMSO 組細(xì)胞中ROS相對熒光強(qiáng)度為1.00±0.02，RSV組細(xì)胞中ROS相對熒光強(qiáng)度為0.44±0.08，與DMSO 組相比，RSV組宮頸癌細(xì)胞中ROS 產(chǎn)生顯著降低(t=11.760,P=0.000)，見圖4。

圖4 RSV對HeLa細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響

2.5 RSV 調(diào)控ADAM9 基因?qū)m頸癌細(xì)胞增殖能力的影響

與RSV 組和RSV+NC 組比較，RSV+sh-ADAM9 組細(xì)胞增殖能力降低，RSV+oe-ADAM9 組細(xì)胞增殖能力增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖5 RSV調(diào)控ADAM9基因?qū)m頸癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.6 RSV 調(diào)控ADAM9 基因?qū)m頸癌細(xì)胞遷移能力的影響

RSV 組、RSV+NC 組、RSV+sh-ADAM9 組和RSV+oe-ADAM9組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為55.67±6.28、53.33±7.81、26.33±5.96、80.33±7.04，與RSV 組和RSV+NC組相比，RSV+sh-ADAM9組細(xì)胞遷移能力明顯降低，RSV+oe-ADAM9 組細(xì)胞遷移能力明顯升高(均P＜0.05)，見圖6。

圖6 Transwell檢測RSV調(diào)控ADAM9基因?qū)m頸癌細(xì)胞遷移能力的影響

2.7 RSV 調(diào)控ADAM9 基因?qū)m頸癌細(xì)胞HeLa ROS的影響

RSV 組、RSV+NC 組、RSV+sh-ADAM9 組和RSV+oe-ADAM9 組ROS 相對熒光強(qiáng)度分別為1.00±0.02、0.98±0.03、0.41±0.05、2.31±0.19，與RSV組 和RSV+NC 組相 比，RSV+sh-ADAM9 組 細(xì) 胞ROS 產(chǎn)生明顯降低，RSV+oe-ADAM9 組細(xì)胞ROS產(chǎn)生明顯增加(均P＜0.05)，見圖7。

圖7 流式細(xì)胞儀檢測RSV調(diào)控ADAM9基因?qū)m頸癌細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

3 討論

研究顯示，雙氫青蒿素、三氧化二砷等為代表的傳統(tǒng)中藥具有來源廣泛、毒副作用較小及療效顯著等優(yōu)勢在抗腫瘤中日益顯現(xiàn)，為改善腫瘤患者臨床效果和延長患者壽命帶來了新希望[4,12]。RSV（3、4、5-三羥基-反式-二苯乙烯）是一種天然的多酚化合物，廣泛存在于葡萄、蔓越莓、花生和紅酒中，由于其抗氧化劑的特性，RSV具有多種有價值的藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌和心血管保護(hù)作用[13]。RSV 的抗腫瘤作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)，目前RSV 在實體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中的抑癌作用均被報道，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等腫瘤生物學(xué)過程[5,14]。Sun等[5]研究發(fā)現(xiàn)，RSV通過抑制HeLa和Ca Ski細(xì)胞中HPV E6 蛋白和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯抑制宮頸癌進(jìn)展。

本研究通過CCK8 實驗和Transwell 實驗發(fā)現(xiàn)，RSV 顯著抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖和遷移能力，表明RSV 能抑制宮頸癌的惡性進(jìn)展，與Sun 等[7]的報道相一致。同時，Sun 等[7]報道RSV 通過調(diào)控STAT3 信號通路降低STAT3 磷酸化狀態(tài)、上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化分子標(biāo)記蛋白質(zhì)水平和細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。細(xì)胞外基質(zhì)降解酶通過降解細(xì)胞外基質(zhì)以促使血管生成是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，研究顯示，金屬蛋白酶（ADAM）家族是細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的重要蛋白，其通過將膜錨定的蛋白質(zhì)在胞外域脫落的過程中將其胞外域分離，而在細(xì)胞增殖、粘附、遷移和侵襲中起關(guān)鍵作用[10]。Lin 等[11]發(fā)現(xiàn)RSV 通過抑制ADAM9蛋白的表達(dá)在肺癌和食管癌中發(fā)揮抗癌作用。

ADAM9 是一種Ⅰ型跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)包含一個用于脫落的金屬蛋白酶域和一個用于粘附的雙整合蛋白域。ADAM9在多種類型的惡性腫瘤中過表達(dá)，增強(qiáng)包括乳腺癌、肺癌和食管癌等細(xì)胞的生長、遷移和轉(zhuǎn)移能力，因此ADAM9 是候選癌基因，是抗腫瘤治療的潛在靶標(biāo)[15]。在宮頸癌中ADAM9同樣被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，并與患者預(yù)后差相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，RSV 能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞中ADAM9 蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗證RSV 是通過調(diào)控ADAM9抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，我們構(gòu)建ADAM9 過表達(dá)和敲減質(zhì)粒，結(jié)果顯示，ADAM9 敲減增強(qiáng)了RSV 對宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，ADAM9 過表達(dá)減弱了RSV 對宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，表明ADAM9 能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移能力，且RSV 通過抑制ADAM9 的表達(dá)在宮頸癌中發(fā)揮抗癌作用。

ROS是由氧氣形成的幾種活性物質(zhì)的總稱，是由一些氧分子以單價還原形式產(chǎn)生的。ROS 是重要的信號分子，通過調(diào)節(jié)血管的結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和分化中發(fā)揮重要作用[16]。在胰腺癌中，RSV 抑制ROS 誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞活化、侵襲、遷移和糖酵解[17]。同時，Dong等[18]報道ADAM9通過增加ROS的產(chǎn)生促使白介素6誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSV能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，且ADAM9 敲減增強(qiáng)了RSV 對宮頸癌細(xì)胞ROS 產(chǎn)生的抑制作用，ADAM9 過表達(dá)減弱了RSV對宮頸癌細(xì)胞ROS產(chǎn)生的抑制作用，表明RSV通過抑制ADAM9 蛋白的表達(dá)減少ROS 的產(chǎn)生進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。

綜上所述，RSV顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，可能是通過抑制ADAM9 蛋白的表達(dá)減少ROS 的產(chǎn)生發(fā)揮作用。ADAM9 可能是RSV 抗宮頸癌治療的潛在分子靶點。