鐵皮石斛多糖減輕高糖誘導的HK-2細胞損傷研究*

韓秀平，譚 娟，賀鈺梅△

（延安大學附屬醫院 1.全科醫學科；2.中醫內科,延安 716000）

糖尿病腎病是糖尿病最普遍、最嚴重的并發癥之一。臨床上，糖尿病腎病以蛋白尿、肌酐水平高和不規則的腎小球濾過率為特點，最終將引發慢性腎功能衰竭[1]。目前，糖尿病腎病仍缺乏治愈方法。因此，有必要發展新的治療策略來緩解糖尿病腎病的發生發展。氧化應激是糖尿病發病機制的主要獨立參與因素[2]，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）是評估氧化應激的重要生理參數。SOD 催化超氧化物轉化為氧氣和過氧化氫，是重要的抗氧化標志物，機體MDA 水平越高，氧化應激反應越嚴重[3]。鐵皮石斛多糖是從我國傳統藥材鐵皮石斛莖中分離出來的主要活性成分，常用于治療肝炎、糖尿病、肥胖癥和類風濕性關節炎[4]。研究表明，鐵皮石斛多糖對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠具有顯著降血糖作用[5]，可緩解糖尿病大鼠氧化應激、炎癥和肝臟脂質積聚等癥狀[6]。然而，鐵皮石斛多糖是否抗糖尿病腎病仍不清楚。微小RNA（MicroRNA，miRNA/miR）是小的非編碼RNA分子，通過與編碼蛋白質的mRNA 的3'非翻譯區結合來調節多種生物學過程。先前的實驗已經暗示，包括miRNA在內的非編碼RNA分子是調節高血糖癥的重要生物標志物，并且它們與糖尿病性腎病有關[7]。根據最近的報道，miR-363 在糖尿病腎病中低表達[8]，白藜蘆醇可能通過上調miRNA mmu-miR-363-3p來改善高脂飲食誘導的小鼠肝胰島素抵抗[9]。因此，miR-363可以用作糖尿病的候選生物標志物或潛在治療靶點。然而，miR-363 在鐵皮石斛多糖介導的糖尿病腎病中的作用尚未見到深入研究的報道。為此，本實驗利用高糖誘導人腎小管上皮細胞HK-2 損傷，觀察鐵皮石斛多糖的保護作用，并結合miR-363，從細胞活性、凋亡和氧化應激方面探討鐵皮石斛多糖的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞HK-2（美國ATCC）；鐵皮石斛多糖（SD9310，北京Solarbio）；miR-363 模擬物、miR-363抑制劑anti-miR-363、模擬物陰性對照miR-NC（上海GenePharma）；細胞計數試劑盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）（CK-04，日本Dojindo）；B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）抗體（ab692，美國Abcam）；Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）抗體（ab77566，美國Abcam）；膜聯蛋白V（AnnexinV）-FITC/碘化丙錠（Propidium Iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（C1062L，上海碧云天）；SOD 檢測試劑盒（S0109，上海碧云天）；MDA檢測試劑盒（S0131S，上海碧云天）；PrimeScript RT試劑盒（RR047A，北京Takara）；Lipofectamine 2000 試劑（11668-019，美國Invitrogen）。

1.2 細胞培養

HK-2細胞在達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）中培養，其中包含10%胎牛血清，生長的培養箱溫度為37 ℃，含5%CO2。

1.3 實驗分組

將HK-2 細胞分為NG 組（正常糖，5 mmol/L 葡萄糖）、HG 組（高糖，30 mmol/L 葡萄糖[10]）、HG+鐵皮石斛多糖-L、M、H 組（30 mmol/L 葡萄糖+100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 鐵皮石斛多糖[11]）、HG+miR-NC組（30 mmol/L葡萄糖+轉染miR-NC）、HG+miR-363 組（30 mmol/L 葡萄糖+轉染miR-363 模擬物）、HG+鐵皮石斛多糖組（30 mmol/L 葡萄糖+400 μg/mL 鐵皮石斛多糖）、HG+鐵皮石斛多糖+anti-miR-363 組（30 mmol/L 葡萄糖+轉染anti-miR-363+400 μg/mL 鐵皮石斛多糖）。HK-2 細胞轉染時，根據Lipofectamine 2000 試劑操作說明進行，轉染6 h 后，以高糖或鐵皮石斛多糖處理，高糖、鐵皮石斛多糖作用時間為48 h。

1.4 CCK-8法測定細胞存活率

各組HK-2細胞（1×104個/孔）接種于96孔板，在DMEM中培養48 h。將10 μL CCK-8溶液與每孔細胞反應2 h。通過酶標儀測量450 nm波長處的細胞光密度（OD）值。存活率（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 流式細胞術測定細胞凋亡率

將各組HK-2 細胞用PBS 洗滌，在結合緩沖液中重懸。將1×106個HK-2細胞分別與5μL Annexin V-FITC、5μL PI避光反應，細胞染色后在BD Biosciences流式細胞儀上測量HK-2細胞的凋亡率。

1.6 Western blotting測定Bax、Bcl-2蛋白表達量

HK-2 細胞經不同處理后，在RIPA 裂解液中進行蛋白的抽提。將30 μg 變性蛋白進行10% SDSPAGE、轉膜。膜在5%無脂牛奶中封閉后，在4 ℃下用Bax、Bcl-2 和對照GAPDH 一抗（均為1∶1 000 稀釋）孵育12 h。隨后室溫下用HRP偶聯的山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000 稀釋）處理1 h。使用增強型化學發光分析系統對膜進行處理，最后將其暴露于X射線膠片，通過掃描OD法評估Bax、Bcl-2蛋白的表達量。

1.7 試劑盒測定氧化應激指標

收集不同處理的HK-2細胞上清液，按照SOD、MDA 檢測試劑盒的操作說明，進行SOD 活性、MDA含量測定。

1.8 定量Real-time PCR測定miR-363的表達

HK-2 細胞使用TRIzol 提取總RNA，并使用上海奧析UV1901 紫外分光光度計檢測RNA 的濃度和純度。使用PrimeScript RT 試劑盒通過逆轉錄將RNA 反轉錄為cDNA（50 ng/μL），并保存在-80 ℃冰箱。根據兩步法，使用ABI 7900HT 實時PCR 系統進行PCR。U6用作miR-363的內參，相對表達使用2-ΔΔCt方法確定。

miR-363 引物，上游：5'-CCAATTGCACGGTATCCAT-3'，下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6引物，上游：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；下游：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.9 統計學方法

將每個實驗3 次重復的數據在SPSS 22.0 軟件中進行整理分析，計量資料以均數±標準差（）表示。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2細胞活性和凋亡的影響

高糖誘導的HK-2細胞后，與NG組相比，HG組細胞存活率降低，凋亡率、Bax蛋白水平增加，Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+鐵皮石斛多糖-L組、HG+鐵皮石斛多糖-M組、HG+鐵皮石斛多糖-H組細胞存活率增加，凋亡率、Bax蛋白水平減少，Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），且均呈濃度依賴性（表1，圖1）。

圖1 鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2細胞活性和凋亡的影響

表1 鐵皮石斛多糖抑制高糖誘導的HK-2凋亡，n=3

表1 鐵皮石斛多糖抑制高糖誘導的HK-2凋亡，n=3

與NG 組相比，aP＜0.05；與HG 組相比，bP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-L 組相比，cP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-M組相比，dP＜0.05。

2.2 鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2氧化應激的影響

與NG 組相比，HG 組HK-2 細胞的SOD 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+鐵皮石斛多糖-L組、HG+鐵皮石斛多糖-M組、HG+鐵皮石斛多糖-H 組HK-2 細胞的SOD 活性逐漸增加，MDA含量逐漸減少（P＜0.05），且均呈濃度依賴性（表2）。

表2 鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2 中SOD 和MDA 表達的影響，n=3

表2 鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2 中SOD 和MDA 表達的影響，n=3

與NG 組相比，aP＜0.05；與HG 組相比，bP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-L 組相比，cP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-M組相比，dP＜0.05。

2.3 鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2 中miR-363表達的影響

與NG 組相比，HG 組HK-2 細胞的miR-363 表達降低（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+鐵皮石斛多糖-L組、HG+鐵皮石斛多糖-M組、HG+鐵皮石斛多糖-H 組HK-2 細胞的miR-363 表達逐漸增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性（表3）。

表3 鐵皮石斛多糖促進高糖誘導的HK-2中miR-363的表達，n=3

表3 鐵皮石斛多糖促進高糖誘導的HK-2中miR-363的表達，n=3

與NG 組相比，aP＜0.05；與HG 組相比，bP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-L 組相比，cP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-M組相比，dP＜0.05。

2.4 過表達miR-363對高糖誘導的HK-2細胞凋亡及氧化應激的影響

在HK-2 細胞中過表達miR-363 后，HG+miR-363組miR-363表達、細胞存活率比HG+miR-NC組高，凋亡率、Bax蛋白水平比HG+miR-NC組低，Bcl-2蛋白水平、SOD活性比HG+miR-NC組高，MDA含量比HG+miR-NC組低（P＜0.05）（表4，圖2）。

圖2 過表達miR-363對高糖誘導的HK-2凋亡的影響

表4 過表達miR-363對高糖誘導的HK-2細胞活性、凋亡及氧化應激的影響，n=3

表4 過表達miR-363對高糖誘導的HK-2細胞活性、凋亡及氧化應激的影響，n=3

與HG+miR-NC組相比，aP＜0.05。

2.5 抑制miR-363 對鐵皮石斛多糖作用的高糖誘導的HK-2凋亡及氧化應激的影響

與HG組相比，HG+鐵皮石斛多糖組、HG+鐵皮石斛多糖+anti-miR-363 組miR-363 表達水平、細胞存活率增加，凋亡率、Bax蛋白水平減少，Bcl-2蛋白水平、SOD 活性升高，MDA 含量降低（P＜0.05）；并且HG+鐵皮石斛多糖+anti-miR-363 組miR-363 表達水平、細胞存活率低于HG+鐵皮石斛多糖組，凋亡率、Bax蛋白水平高于HG+鐵皮石斛多糖組，Bcl-2 蛋白水平、SOD 活性低于HG+鐵皮石斛多糖組，MDA含量高于HG+鐵皮石斛多糖組（表5，圖3）。

表5 抑制miR-363可逆轉鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2凋亡及氧化應激的作用，n=3

表5 抑制miR-363可逆轉鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2凋亡及氧化應激的作用，n=3

與HG組相比，aP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖組相比，bP＜0.05。

圖3 抑制miR-363可逆轉鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2凋亡的影響

3 討論

腎小管細胞是糖尿病腎病的主要靶點，它在糖尿病腎病病理進展中發揮重要作用[12]。早期糖尿病腎病出現腎小管上皮細胞的凋亡及氧化損傷現象[13]。因此，找到可以靶向腎小管上皮細胞凋亡及氧化損傷的有效藥物，將有助于阻斷糖尿病腎病進程。本研究分析了鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2細胞存活率、凋亡和氧化應激過程的影響，發現鐵皮石斛多糖可以保護高糖誘導的HK-2 細胞損傷，其可能成為糖尿病腎病的潛在治療藥物。并且，其機制與miR-363密切相關。

腎小管上皮細胞凋亡是糖尿病腎病的重要特征[14]。Bcl-2 家族是線粒體凋亡途徑的主要調節因子，影響一系列參與調節細胞凋亡的下游基因，包括促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2[15]。資料顯示，鐵皮石斛多糖可以增強高糖處理的人角膜上皮細胞活性、Bcl-2 水平，減弱其凋亡、Bax 水平[11]。鐵皮石斛多糖對高糖誘導的血管內皮細胞生長、Bcl-2表達具有促進作用，對Bax 表達具有抑制作用[16]。本研究中，100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 鐵皮石斛多糖促進高糖誘導后HK-2 細胞的存活率、Bcl-2水平，并抑制高糖引起的HK-2 細胞凋亡率、Bax 水平增加，說明在高糖誘導后HK-2細胞中，鐵皮石斛多糖可以增加細胞活性，減輕細胞凋亡，與前述研究相似。

氧化應激被認為是糖尿病腎病發病機理和進展的關鍵因素[17]。腎小管上皮細胞中氧化應激水平升高與高糖環境有關，這可能導致腎功能障礙[18]。脂質過氧化物的產物MDA水平升高可以用作氧化應激的標志，細胞內SOD活性降低表明體內抗氧化能力降低[19]。鐵皮石斛多糖被報道可以增強2型糖尿病小鼠的抗氧化活性，提高SOD和過氧化氫酶活力[20]。在腎陰虛大鼠中，鐵皮石斛多糖通過提高SOD 活性，降低MDA 含量改善大鼠的抗氧化能力[21]。本研究中，高糖處理使HK-2 細胞抗氧化酶SOD 的活性降低，MDA 含量增加，導致HK-2 細胞的氧化應激，與前人的研究[19]相符合。而不同濃度鐵皮石斛多糖的治療增加了高糖誘導后HK-2細胞的SOD活性，并減少MDA含量，可見鐵皮石斛多糖能夠減輕高糖所致的HK-2 細胞氧化應激。因此，鐵皮石斛多糖通過調節細胞活性、凋亡和氧化應激水平，對高糖誘導的HK-2細胞產生保護作用。

miR-363在2型糖尿病中發揮作用，是糖尿病風險的預后生物標志物[22]，但其在糖尿病腎病中的詳細功能仍然未知。研究表明，在轉化生長因子β1處理的HK-2 細胞中，miR-363-3p 的水平顯著降低，miR-363-3p對體外腎纖維化起保護作用[23]。在鏈脲佐菌素誘導的2 型糖尿病大鼠中，大鼠膀胱逼尿肌組織中miR-363 的表達降低，上調miR-363 導致大鼠逼尿肌細胞中Bcl-2表達增加，加速細胞存活，同時降低細胞凋亡和Bax 的表達，從而改善2 型糖尿病大鼠的逼尿肌纖維化[24]。本研究中，高糖降低HK-2 細胞中miR-363 表達，這與彭睿等[8]觀察到的miR-363在糖尿病腎病表達下調一致，提示miR-363與糖尿病腎病進展有關。本研究還檢測到與前述報告[23-24]類似的結果，即過表達miR-363使高糖誘導的HK-2 細胞的存活率、Bcl-2 水平增加，凋亡率、Bax 水平減少。同時，過表達miR-363 還增加了高糖誘導的HK-2 細胞SOD 活性，減少MDA 含量，表現出其抗氧化能力。另外，不同濃度鐵皮石斛多糖促進高糖誘導的HK-2細胞的miR-363表達，并且鐵皮石斛多糖對高糖誘導的HK-2 細胞活性、凋亡及氧化應激的影響被抑制miR-363所逆轉。說明鐵皮石斛多糖保護高糖誘導的HK-2細胞損傷的功能是通過促進miR-363表達來實現的。

總之，本研究發現鐵皮石斛多糖對糖尿病腎病產生潛在的保護作用，能增強高糖誘導的HK-2 細胞活性，減弱細胞凋亡，并改善氧化應激，機制與上調miR-363表達有關。這為鐵皮石斛多糖治療糖尿病的機制提供了新的見解。