SASH1表達對膽囊癌細胞增殖、凋亡和轉移的作用機制研究*

吳 博，王欣欣，劉麗莉，包小娜，蔡 宇△

（遼寧健康產業集團阜新礦總醫院 1.消化內科；2窺鏡中心，阜新 123000）

膽囊癌在膽道系統惡性腫瘤中發病率最高，在全球消化系統常見惡性腫瘤中排名第六，腫瘤流行病學調查顯示，2018年新發和死亡膽囊癌患者超過15萬[1]。由于膽囊癌早期診斷較難以及復發和轉移等重要因素的存在，膽囊癌患者的預后極差[2]。雖然醫療在不斷的進步，但是現有的治療策略仍不能改善膽囊癌的臨床療效，因此揭示其發病分子機制可能有助于鑒定治療膽囊癌新的治療靶標。SASH1(scaffold protein sterile α motif-and Src-homology 3-domain containing 1,SAM and SH3 domain-containing 1)基因在正常人體組織中廣泛表達，該基因調節細胞的生長、增殖和凋亡，并參與多種疾病的發展[3]。SASH1 被認為是腫瘤抑制基因，在乳腺癌、非小細胞肺癌和胃癌等常見惡性腫瘤中低表達，通過調控細胞增殖、凋亡和侵襲轉移等腫瘤生物學過程促進腫瘤的惡性進展[4-6]。SASH1 在多種腫瘤中被研究，并可以作為抗腫瘤治療的靶點[7]，但是SASH1 在膽囊癌中的研究至今未有報道。因此，本研究對SASH1在膽囊癌中的表達及在膽囊癌發生發展中的生物學功能和作用機制進行了探討，旨在獲得SASH1作為膽囊癌抗腫瘤治療潛在分子靶點的依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

高效蛋白裂解液和吉姆薩染液，購自北京solarbio公司；蛋白上樣緩沖液和BCA檢測試劑盒，購自上海碧云天試劑有限公司；PVDF膜，購自美國Millipore 公司；SASH1 一抗和鼠二抗、兔二抗，購自美國proteintech公司；ECL化學發光試劑盒，購自美國Thermo公司；膽囊癌細胞GBC-SD、MKN-45、GES-1和人正常胃粘膜上皮細胞系RGM-1，購自美國ATCC 細胞庫；細胞培養基、FBS 和胰酶，購自美國Hyclone公司；SASH1 siRNA，購自廣州銳博生物生物技術有限公司；MTS 試劑，購自美國Biovision 公司；細胞凋亡檢測試劑盒，購自南京凱基生物技術有限公司；Transwell 小室，購自美國coring 公司；4周齡左右的雌性BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 樣本來源

收集2018 年1 月至2020 年1 月入住遼寧健康產業集團阜新礦總醫院行手術治療的膽囊癌患者31例，要求患者在本次手術前未接受過放化療等任何形式的抗腫瘤治療。膽囊癌及大于腫瘤組織5 cm以上的癌旁組織，均由經病理專家證實。手術切除的新鮮組織標本，放置-80 ℃冰箱中儲存備用。患者均簽署知情同意書，所有操作均由本院倫理委員會審核通過。

1.3 Western blotting檢測SASH1蛋白表達

組織加入高效蛋白裂解液，超聲裂解細胞。12 000 r/min、4 ℃離心30 min，去除沉淀，獲得細胞總蛋白。BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液，蛋白加熱煮沸進行變性。采用10%的SDS-PAGE 凝膠進行蛋白電泳，濕轉進行轉膜。將PVDF 膜與蛋白封閉液常溫孵育1 h 后分別與目的一抗稀釋液（稀釋濃度比均為1∶500）4 ℃孵育過夜、二抗稀釋液（1∶8 000）室溫孵育1 h后，采用ECL試劑盒曝光蛋白條帶。

1.4 細胞培養和細胞轉染

膽囊癌細胞GBC-SD、SGC996、NOZ 和正常膽管上皮細胞HIBEpiC 從液氮快速復蘇后，采用含10%FBS的DMEM培養基培養細胞，放置在37 ℃、5%CO2的全濕度培養箱中。細胞長滿時，收集各個細胞進行細胞裂解，獲得細胞蛋白裂解液，采用western blotting 檢測各個細胞中SASH1 蛋白的表達。并選擇SASH1 表達最高的膽囊癌細胞進行6 孔板接種，每孔2×105個細胞，分為NC 組和Overexpression SASH1 組(oe-SASH1 組)。繼續培養12 h，棄掉培養基后，更換無血清培養基，NC組細胞加入NC 質粒、siRNA 和lip2000，oe-SASH1 組細胞加入SASH1 過表達質粒和lip2000。轉染48 h 后收集細胞蛋白，采用western blotting 檢測各組細胞中SASH1的表達，并進行后續實驗。

1.5 MTS實驗

收集NC 組和oe-SASH1 組細胞進行96 孔板接種，每孔2×103個細胞，以細胞貼壁的時間計為0點，每組設置0 h、24 h、48 h、72 h和96 h時間點，及每個時間點設置6 個復孔，放置培養箱中培養。在相對應的時間點，每孔中加入20 μL MTS試劑，在培養箱中繼續孵育2 h。采用酶標儀檢測490nm 處各孔的吸光度值（OD值）。

1.6 細胞凋亡實驗

NC組和oe-SASH1組細胞PBS洗兩次后，采用無EDTA 的胰酶消化收集，PBS 洗兩次，每管6×105個細胞，每組設置3個管，每管加入500 μL的凋亡染色緩沖液重懸細胞及5 μL 的Annexin V-FITC 和PI染色液，在常溫下避光孵育10 min 后，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.7 Transwell實驗

收集NC組和oe-SASH1組細胞，無血清培養基洗兩次后進行Transwell 小室孔接種，每孔1×105個細胞、100 μL 無血清培養基，細胞接種至Transwell小室膜的上室面，其下室面放于含有血清的細胞培養基中，將細胞放置培養箱中培養12 h。將Transwell 小室取出，其膜的上室面細胞擦除后，下室面的細胞經PBS 清洗、甲醇固定和吉姆薩染色后，在顯微鏡下觀察膜下室面的細胞數目，細胞數越多，表明細胞穿膜數越多，細胞轉移能力越強。

1.8 裸鼠體內成瘤實驗

收集NC組和oe-SASH1組細胞，PBS洗兩次后進行裸鼠接種，每只裸鼠4×106個細胞、100 μL PBS，細胞懸液接種至裸鼠的右側腋窩下。采用游標卡尺每周對裸鼠成瘤的體積進行測量，接種4 周時處死裸鼠，解剖移植瘤，并對瘤體進行稱重。

1.9 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行數據統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用DUNNETt檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SASH1在膽囊癌組織中的表達水平

SASH1 在膽囊癌組織和癌旁組織中的相對表達量分別為（1.04±0.33）和（1.38±0.59），SASH1在膽囊癌組織中的表達顯著低于其在癌旁組織中的表達（t=2.773,P=0.007）。

2.2 SASH1蛋白在膽囊癌細胞系中的表達水平

與正常膽管上皮細胞HIBEpiC相比，SASH1在膽囊癌細胞中的表達均顯著降低（F=195.34,P＜0.001），其中在GBC-SD 細胞中的表達最低（P＜0.05），見圖1A。GBC-SD轉染SASH1過表達質粒，結果顯示，與NC 組相比，oe-SASH1 組中SASH1 相對表達量顯著增加（t=8.62,P＜0.001），見圖1B。

圖1 SASH1蛋白在膽囊癌細胞系中的表達水平

2.3 細胞增殖能力的檢測

與NC組相比，24 h之后，oe-SASH1組GBC-SD細胞各個時點的OD 值顯著降低，增殖能力降低（P＜0.05），見表1。

表1 不同時間點NC組和oe-SASH1組GBC-SD細胞的OD值

表1 不同時間點NC組和oe-SASH1組GBC-SD細胞的OD值

2.4 細胞凋亡的檢測

NC組和oe-SASH1組細胞凋亡率分別為（4.61±0.39）和（14.38±2.16），與NC 組相比，oe-SASH1 組GBC-SD 細胞凋亡率顯著增加（t=7.710,P=0.001），見圖2。

圖2 流式細胞實驗檢測SASH1對膽囊癌細胞凋亡的影響

2.5 細胞轉移能力的檢測

NC 組和oe-SASH1 組細胞穿膜數分別為（68.67±7.39）和（44.33±4.85），與NC 組相比，oe-SASH1 組GBC-SD 細胞轉移能力顯著降低（t=4.769,P=0.005），見圖3。

圖3 Transwell實驗檢測SASH1 siRNA對膽囊癌細胞GBCSD轉移能力的影響

2.6 細胞凋亡體內成瘤能力的檢測

采用裸鼠成瘤檢測NC 組和oe-SASH1 組膽囊癌細胞體內生長能力，結果顯示，與NC 組相比，oe-SASH1 組GBC-SD 細胞體內成瘤能力顯著降低（P＜0.001），見圖4。

圖4 裸鼠成瘤實驗檢測各組細胞裸鼠成瘤體積

2.7 SASH1 siRNA 對PI3K/AKT 信號通路及其下游基因表達的影響

oe-SASH1 組GBC-SD 細胞中PI3K/AKT 信號通路相關蛋白pPI3K 和pAKT 的表達減少，但是總蛋白PI3K和AKT蛋白的表達無顯著變化，見圖5和表2。

圖5 Western blotting 實驗檢測SASH1 對膽囊癌細胞GBCSD細胞周期蛋白和轉移蛋白表達的影響

表2 SASH1的表達對PI3K/AKT信號通路及其下游基因表達的影響

表2 SASH1的表達對PI3K/AKT信號通路及其下游基因表達的影響

3 討論

膽囊癌是膽道中最具有侵略性和最常見的惡性腫瘤[1]。膽囊癌的唯一且可能的治療方法是手術切除，但由于隱匿性早期癥狀和缺乏診斷標志物，在臨床診斷出膽囊癌時，癌細胞大部分已入侵鄰近器官并通過淋巴結轉移，喪失了手術機會。晚期膽囊癌患者對化療藥物反應有限，導致了高死亡率。研究顯示，T1 和T2 期的膽囊癌患者5 年生存率分別為85.9%和56.1%，而T3和T4期的膽囊癌患者5年生存率分別下降至19.2%和14.1%[2]。膽固醇代謝和膽結石等被認為是膽囊癌的主要高危因素，但是膽囊癌具體的發生發展機理尚未完全闡明[8]。目前已經確定癌基因和抑癌基因參與惡性腫瘤的發展，這表明基因研究可能為開發延長膽囊癌患者生存期的有效藥物提供新的靶點[9]。

SASH1 基因屬于信號銜接蛋白SLY 家族的一個成員，定位于細胞核，包含SAM和SH3結構域，具有信號銜接和分子支架的功能，在正常生命活動中發揮重要作用，如SASH1通過一氧化氮信號傳導參與調節肺泡上皮細胞成熟過程，以及SASH1在胚胎發育過程中也發揮重要作用[3]。研究顯示，SASH1異常表達引起多種腫瘤的惡性進展，是一個新型的腫瘤抑制基因。Zeller等[10]于2003年首次報道在乳腺癌樣品中SASH1的表達顯著降低。同時，SASH1基因位于染色體6q23-25，該區域為肺癌易感性基因座，SASH1 與肺癌的發生發展密切相關[11]，SASH1低表達預示非小細胞肺癌患者預后不良，同時，過表達SASH1可以抑制腫瘤細胞的增殖和對順鉑的敏感性[5]。在胃癌組織中SASH1的表達顯著低于其癌旁組織，SASH1 低表達與胃癌患者TNM 分期顯著相關，是胃癌患者獨立的預后因素[6]。但是SASH1在膽囊癌中的表達情況未知，本研究結果顯示，與癌旁組織相比，SASH1 在膽囊癌組織中的表達顯著下調，但是本研究膽囊癌組織樣本較少，未能分析SASH1 表達水平與膽囊癌臨床病理參數的關系，后續還需進一步擴大樣本進行研究。

盡管SASH1在膽囊癌組織中表達異常，其發揮的功能及作用機制仍有待闡明。目前研究已經充分顯示SASH1 調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等惡性生物學功能[4-7]。本研究結果顯示，SASH1在膽囊癌細胞中的表達顯著低于在正常膽管上皮細胞HIBEpiC中的表達，并選擇SASH1表達最低的膽囊癌細胞進行轉染SASH1 過表達質粒，過表達SASH1 抑制膽囊癌細胞增殖、轉移和體內成瘤能力，以及促進細胞的凋亡，表明SASH1 抑制膽囊癌的惡性進展。SASH1 在蛋白激酶B（Akt）中的抑制作用被認為是SASH-1 抗癌作用的潛在分子機制。SASH1 過表達通過降低p-Akt 及其包括cyclin D1，Bcl-2和MMP-2靶基因的表達水平抑制人皮膚鱗狀細胞癌細胞的增殖和侵襲能力[12]。Sun 等[13]報道，SASH1可能通過在體內和體外下調PI3K/AKT信號通路抑制肝癌細胞的侵襲和轉移能力。在骨肉瘤中SASH1 通過PI3K/AKT 信號通路抑制細胞增殖和遷移能力，促進細胞凋亡[14]。PI3K/AKT在膽囊癌中也處于異常激活狀態[15]，在膽囊癌細胞系中我們發現SASH1 抑制pPI3K 和pAKT 蛋白的表達，表明SASH1在膽囊癌中同樣通過下調PI3K-AKT信號通路發揮抑癌作用。

綜上所述，SASH1 在膽囊癌組織中低表達，SASH1可能通過調控PI3K/AKT信號通路抑制膽囊癌細胞的增殖和轉移，促進細胞的凋亡。SASH1可能是膽囊癌抗治療的潛在分子靶點。