不同規格平貝母化學成分比較研究

趙倩 李波 關瑜 孔玲 孟祥才

摘要 [目的]以總生物堿、4種代表性生物堿作為評價指標，評價4種規格平貝母的質量。[方法]采用紫外分光光度法測定總生物堿、總多糖含量;采用HPLC-ELSD法測定單體生物堿含量。[結果]最小粒（6.5 mm）平貝母中總生物堿、貝母辛、西貝母堿、貝母素甲、貝母素乙含量分別為2.54 mg/g、92.73 μg/g、67.09 μg/g、87.58 μg/g、82.81 μg/g，大、中、小粒平貝母（11～19 mm）中總生物堿、貝母辛、西貝母堿、貝母素甲、貝母素乙含量分別為2.17～2.51 mg/g、12.45～49.31 μg/g、29.50～35.13 μg/g、35.02～94.69 μg/g、18.02～84.20 μg/g。最小粒平貝母中單體生物堿、總生物堿含量顯著高于大、中粒平貝母中的含量，但總多糖含量顯著低于大、中、小粒平貝母。大、中、小粒平貝母中各種成分含量差異不大。[結論]直徑6.5 mm左右的最小粒平貝母質量最佳，直徑11～19 mm大小的平貝母質量無差異，質量與大小并不呈現完全的相關。

關鍵詞 平貝母;總生物堿;主要生物堿;總多糖

中圖分類號 R 284? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）23-0206-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.058

Comparative Study on the Chemical Composition of Fritillaria ussuriensis with Different Specifications

ZHAO Qian，LI Bo，GUAN Yu et al

（Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] Using total alkaloids and 4 representative alkaloids as evaluation indicators to evaluate the quality of four specifications of Fritillaria ussuriensis. [Method]The total alkaloid and total polysaccharide content were measured by ultraviolet spectrophotometry;the monomer alkaloid content was measured by the HPLC-ELSD method. [Result]The contents of total alkaloid， peimisine，imperialine，peimine and peiminine in the smallest （6.5 mm） Fritillaria ussuriensis were：2.54 mg/g，92.73μg/g，67.09 μg/g，87.58 μg/g，82.81μg/g，the contents of total alkaloid， peimisine，imperialine，peimine and peiminine in large， medium and small （11-19 mm） Fritillaria ussuriensis were 2.17-2.51 mg/g，12.45-49.31 μg/g， 29.50-35.13 μg/g， 35.02-94.69 μg/g， 18.02-84.20 μg/g.The various monomer alkaloids and total alkaloid content of the smallest Fritillaria ussuriensis were significantly higher than those of the large and medium one，the total polysaccharide content was significantly lower than that of others. There was little difference in the content of various components between the large， medium and small Fritillaria ussuriensis. [Conclusion]The smallest Fritillaria ussuriensis with a diameter of about 6.5 mm has the best quality. There is no difference in the quality of Fritillaria ussuriensis with a diameter of 11-19 mm， and there is no complete correlation between quality and size.

Key words Fritillaria ussuriensis;Total alkaloids;Major alkaloids;Total polysaccharides

基金項目 2018年中醫藥公共衛生服務補助專項“全國中藥資源普查項目”（財社〔2018〕43號）;黑龍江中醫藥大學校基金面上項目（201808）。

作者簡介 趙倩（1995—），女，山東煙臺人，碩士研究生，研究方向：藥用植物資源。

通信作者，教授，博士，博士生導師，從事藥用植物資源研究。

收稿日期 2021-03-31

平貝母為百合科植物平貝母（Fritillaria ussuriensis Maxim.）的干燥鱗莖，主要含有生物堿類、多糖類等成分，具有鎮咳化痰、潤肺平喘、清熱散結、抗炎、降壓、抗氧化、抗潰瘍、抗血小板凝集等藥理作用[1]。《中華人民共和國藥典》2010年版開始收錄，現已成為東北的道地藥材。研究證明總生物堿是平貝母的主要活性成分。異甾體生物堿是生物堿中最主要有效成分，代表成分為貝母辛、西貝母堿、貝母素甲、貝母素乙等[2]。

平貝母的藥用部位為鱗莖，其在1～6年隨生長年限的增加而不斷增大。雖然各年生不同大小規格平貝母鱗莖均可入藥，但其商品價格相差較大，其中2年生最小粒平貝母價格約為4～5年生中粒平貝母的2倍，且流通較快[3]。目前平貝母大小規格與質量關系并不明確，筆者以總生物堿及4種代表性生物堿作為質量評價標準，以期為合理評價平貝母藥材質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。

平貝母于2019年6月1日采自黑龍江中醫藥大學藥用植物園。大粒平貝母為6年生鱗莖（直徑19.0 mm左右），中粒平貝母為4～5年生鱗莖（直徑14.0 mm左右），小粒平貝母為3年生鱗莖（直徑11.0 mm左右），最小粒平貝母為2年生鱗莖（直徑6.5 mm左右）。

1.1.2 儀器。

722E 型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）;KQ-300E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）;waters 2695-2996型高效液相色譜儀（美國waters公司）;Alltech 2000蒸發光散射檢測器（美國Alltech公司）;KDC-160HR型高速低溫離心機（合肥科大創新有限公司）。

1.1.3 試藥。

氯仿、濃氨水甲醇、乙醇、石油醚、乙醚均為分析純;貝母辛、西貝母堿、貝母素甲、貝母素乙對照品純度≥98%，購于上海源葉生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物堿含量測定。

1.2.1.1 供試品溶液的制備。

精密稱定不同規格的平貝母粉末（過60目篩）2.0 g置圓底燒瓶中，加入濃氨試液3.0 mL，靜置2 h。加 CHCl3-甲醇（4∶1）的混合溶液 45.0 mL，置 80 ℃水浴加熱回流2 h，放冷，濾過，用適量 CHCl3-甲醇（4∶1）混合溶液洗滌藥渣 2～3 次，合并濾液，蒸干，殘渣加CHCl3使溶解，轉移至 25 mL容量瓶中，加 CHCl3至刻度，搖勻，即得[4]。

1.2.1.2 標準曲線的繪制。

精密吸取貝母素乙對照品9.92 mg，置于100 mL容量瓶中，加 CHCl3溶解并稀釋至刻度，即得對照品溶液。精密量取對照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加入 0.2 mol/mL pH 5.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液，再精密加0.03%溴百里香酚藍試液（取溴百里香酚藍 0.03 g，用1 mol/L NaOH 溶液0.5 mL使溶解，加水稀釋至100 mL，即得）2.0 mL，加CHCl3至刻度，劇烈振搖，轉移至分液漏斗中，放置45 min。取 CHCl3液，用干燥濾紙濾過，取續濾液，以相應的試劑為空白，按紫外-可見分光光度法（通則0401）在 412 nm波長處測定吸光度，以吸光度（y）為縱坐標、總生物堿濃度（x，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.1.3 空白對照。

在25 mL容量瓶中加入適量CHCl3溶液，再加0.2 mol/mL鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液5 mL，再精密加0.03%溴百里香酚藍試液2.0 mL，加CHCl3至刻度，劇烈振搖，轉移至分液漏斗中，放置45 min。取 CHCl3液，用干燥濾紙濾過，取續濾液。

1.2.1.4 精密度、重復性、穩定性考察。

取同一貝母素乙對照品溶液，測定吸光度，連續測定6次，計算其RSD值;取供試樣品溶液1份，重復測定6次，計算其RSD值;取樣品溶液，分別于放置至0、2、4、6、8、10 h測定吸光度，計算其RSD值。

1.2.1.5 加樣回收率考察。

精密吸取已知含量的供試液5份，分別加入貝母素乙對照品溶液，測定吸光度，計算回收率。

1.2.1.6 樣品的含量測定。

精密量取供試品溶液2.0 mL至25 mL容量瓶中。精密加入0.2 mol/mL鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液5.0 mL，再精密加入0.03%溴百里香酚藍試液2.0 mL，加CHCl3至刻度，劇烈振搖，轉移至分液漏斗中，放置45 min，然后濾紙濾過，測定412 nm波長處吸光度（相應溶劑為參比溶液），計算平貝母總生物堿的得率：W=（C×F×V）/m×100%[5]，式中，W為總生物堿含量（%）;C為溶液濃度（mg/mL）;F為溶液稀釋倍數;V為溶液體積（mL）;m為樣品質量（mg）。

1.2.2 主要生物堿含量測定。

1.2.2.1 色譜條件。

色譜柱為Agilent Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.03%二乙胺水溶液（B），流速為1.0 mol/mL，柱溫30 ℃。漂移管溫度96 ℃，增益值為2，進樣量10 μL。線性梯度洗脫程序：0～15 min，45～28（B）;15～17 min，28～25（B）;17～22 min，25～20（B）;22～25 min，20～15（B）;25～50 min，15～10（B）;50～55 min，10～45（B）[6]。

1.2.2.2 對照品溶液的制備。

精密稱定貝母辛、西貝母堿、貝母素甲、貝母素乙標準品適量，加入甲醇制得每1.0 mL分別含193、103、116、98 μg的對照品混合溶液。

1.2.2.3 供試品溶液的制備。

制備方法同“1.2.1.1”。取濾液過0.22 μm微孔濾膜過濾即得[7]。

1.2.2.4 線性關系考察。

分別精密吸取對照品儲備液，稀釋至0、2、5、10、50倍，按照“1.2.2.1”色譜條件測定。

1.2.2.5 精密度、穩定性考察。

取同一貝母辛對照品溶液，測定峰面積，連續測定6次，計算RSD值;取樣品溶液，分別于放置至0、2、4、8、12、24 h測定峰面積，計算RSD值。

1.2.2.6 加樣回收率考察。

精密吸取已知含量的供試品溶液4份，分別加入貝母辛、西貝母堿、貝母素甲、貝母素乙對照品溶液，測定峰面積，計算回收率。

1.2.2.7 樣品的含量測定。

取不同規格平貝母的供試品溶液，按“1.2.2.1”色譜條件進樣，記錄峰面積并計算RSD值。重復3次。

1.2.3 總多糖含量測定。

1.2.3.1 供試品溶液的制備。

取平貝母粗粉（20目）5.0 g，每次分別加蒸餾水150 mL，加熱提取2次，每次1 h，合并濾液，于60 ℃旋轉蒸發儀中濃縮至100 mL，然后緩慢加入約7倍量的95%乙醇，邊加邊攪拌，靜置過夜，得到粗多糖[8]。沉淀用乙醇、石油醚反復洗滌去雜質，加蒸餾水復溶。取上清液加Sevage 試劑（氯仿∶正丁醇= 4∶1）10 mL，劇烈振搖20 min，常溫下4 000 r/min離心 10 min，重復上述操作 5 次，直到完全脫除蛋白為止。樣品經抽濾、真空干燥后得到精制貝母多糖[9]。

1.2.3.2 葡萄糖標準曲線的繪制。

精確稱取經干燥至恒重的標準無水葡萄糖20.00 mg，用50 mL蒸餾水定容，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，以水補至 2.0 mL，然后加入6.0%苯酚水溶液 1.0 mL，再迅速加入濃硫酸 5.0 mL，顯色后在冷水中冷卻，以蒸餾水代替糖溶液作空白對照，在490 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.3.3 精密度、重復性、穩定性考察。

取無水葡萄糖對照品溶液，測定吸光度，連續測定6次，計算其RSD值;取供試樣品溶液1份，重復測定6次，計算其RSD值;取樣品溶液，分別于放置至0、2、4、6、8、10 h測定吸光度，計算其RSD值。

1.2.3.4 加樣回收率考察。

精密吸取已知含量的供試品溶液5份，分別加入無水葡萄糖對照品溶液，測定吸光度，計算回收率。

1.2.3.5 樣品的含量測定。

準確稱取 25.00 mg貝母多糖，定容至25 mL，測定樣品吸光度。吸取多糖溶液1.0 mL，加入蒸餾水1.0 mL，然后加入6.0%苯酚水溶液1.0 mL，再迅速加入濃硫酸5.0 mL，顯色后在冷水中冷卻，以蒸餾水代替多糖溶液作空白對照，490 nm處測定吸光度，平行測定 3 次，得到多糖溶液的吸光度。根據標準曲線計算平貝母總多糖含量[10]。

2 結果與分析

2.1 不同規格的平貝母中總生物堿含量

2.1.1 標準曲線的繪制。按照“1.2.1.2”方法操作，以吸光度（y）為縱坐標、總生物堿濃度（x，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得出線性回歸方程為y=28.196x+0.072 1（R2=0.999 3），表明總生物堿濃度在0.002～0.020 mg/mL有良好的線性關系。

2.1.2 精密度、重復性、穩定性考察。按照“1.2.1.4”方法操作，精密度、重復性、穩定性的RSD值分別為1.60%、2.23%和1.98%。

2.1.3 加樣回收率考察。按照“1.2.1.5”方法操作，平均回收率為100.55%，RSD為2.76%，說明該方法準確可靠。

2.1.4 總生物堿的含量。經測定，大、中、小和最小粒平貝母中總生物堿的含量分別為2.25、2.17、2.51、2.54 mg/g。與最小粒平貝母比較，大、中粒平貝母中總生物堿含量均有極顯著差異（P<0.01），小粒平貝母中總生物堿含量沒有顯著差異（P>0.05）;與小粒平貝母比較，大、中粒平貝母中總生物堿含量均有極顯著差異（P<0.01）。

2.2 不同規格的平貝母中主要生物堿含量

2.2.1 線性關系考察。按照“1.2.2.4”方法操作，貝母辛、西貝母堿、貝母素甲、貝母素乙的線性方程、決定系數（R2）和線性范圍如表1所示。

2.2.2 精密度、穩定性考察。按照“1.2.2.5”方法操作，從表2可以看出，精密度、穩定性的RSD值分別為1.04%～2.01%、1.70%～2.80%。

2.2.3 加樣回收率考察。按照“1.2.2.6”方法操作，從表2可以看出，貝母辛、西貝母堿、貝母素甲、貝母素乙的平均回收率為98.93%～103.03%，RSD為2.28%～2.72%，說明該方法準確可靠。

2.2.4 主要單體生物堿的含量。從表3可以看出，大、中、小粒平貝母的貝母辛、西貝母堿、貝母素甲、貝母素乙含量分別為12.45～49.31、29.50～35.13、35.02～94.69、18.02～84.20 μg/g，最小粒平貝母中4種單體生物堿含量分別為92.73、67.09、87.58、82.81 μg/g，可見最小粒平貝母單體生物堿含量顯著高于大、中粒平貝母中的含量。與最小粒平貝母比較，大、中、小粒平貝母中貝母辛、西貝母堿、貝母素甲的含量均有極顯著差異（P<0.01），大、中粒平貝母中貝母素乙有極顯著差異（P<0.01）。與小粒平貝母比較，大、中粒平貝母中貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的含量均有極顯著差異（P<0.01）;中粒平貝母中西貝母堿含量有極顯著差異（P<0.01）。

2.3 不同規格的平貝母中總多糖含量

2.3.1 線性關系考察。按照“1.2.3.2”方法操作，以吸光度（y）為縱坐標、葡萄糖濃度（x，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得出線性回歸方程為y=45.014x+0.126 0（R2=0.999 1），表明在葡萄糖濃度0.002～0.240 mg/mL有良好的線性關系。

2.3.2 精密度、重復性、穩定性考察。按照“1.2.3.3”方法操作，精密度、重復性、穩定性的RSD值分別為0.84%、1.27%、1.17%。

2.3.3

加樣回收率考察。按照“1.2.3.4”方法操作，平均回收率為100.44%，RSD為2.25%，表明該方法準確可靠。

2.3.4 總多糖的含量。經測定，大、中、小和最小粒平貝母中總多糖含量分別為16.06、15.33、15.94、10.71 mg/g。與最小粒平貝母比較，大、中、小粒平貝母中總多糖含量均有顯著差異（P<0.01）。與小粒平貝母比較，大、中粒平貝母中總多糖含量均無顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結論

平貝母是多年生草本植物，其主要為鱗莖繁殖，1～4年生平貝母鱗莖處于不斷增長趨勢，4年生以上開始在老的鱗葉上產生分化的小鱗莖，種植的平貝母常會形成不同年生的混合體。2～3年生植株僅有一片披針形葉，為營養生長期;4～5年生植株產生地上莖而不開花;5～6年生植株開花，進入生殖生長后會消耗大量的光合產物用于花、果實和種子的生長。不同生長發育階段莖葉生長、生殖生長等都會對營養物質積累產生重要影響，也會對藥材質量產生重要影響[8]，通常認為生長年限較低，藥材質量較差。通過對湖北貝母的貝母甲素、湖貝甲素含量測定，也發現一年生大粒組內在品質優于其他組[11]。平貝母藥材規格通常以大小來表示，但與其他藥材恰恰相反，個體越小，價格反而越高，所以該研究比較大粒（直徑19.0 mm左右）、中粒（直徑14.0 mm左右）、小粒（直徑11.0 mm左右）與最小粒（直徑6.5 mm左右）平貝母主要活性成分含量的差異。最小粒平貝母一般是通過營養生長直接產生的小鱗莖，其積累的多糖含量也較少，經過第2年營養生長，其多糖類成分含量也增加，各種單體生物堿、總生物堿含量也顯著高于大、中粒平貝母的含量，其中總多糖含量與總生物堿含量呈顯著負相關，顯示最小粒平貝母的質量可能與植物個體生長發育階段相關，從而造成與其他組平貝母的差異。但對于大、中、小粒平貝母來說，各種成分含量差異不大，藥理也顯示上述3種規格平貝母在止咳、祛痰、抗炎方面藥理效果無顯著差異[12]。

由此可見，直徑6.5 mm左右的平貝母質量最佳，直徑11～19 mm大小的平貝母質量無差異，質量與大小并不呈現完全的相關。

參考文獻

[1] 張曼，張宇，徐少博，等.平貝母多糖鐵配合物的合成、結構特征及抗氧化活性[J].食品科學，2020，41（6）：36-42.

[2] 沈瑩，孫海峰.平貝母化學成分及藥理作用研究進展[J].化學工程師，2018，32（6）：62-66.

[3] 桂鏡生，楊樹德.川貝母與平貝母的資源狀況調查及市場供求分析[J].云南中醫學院學報，2008，31（6）：36-39.

[4] 孫海峰，沈瑩.平貝母總生物堿提取工藝優化研究[J].化學工程師，2018，32（4）：9-11，15.

[5] 朱林.貝母藥材中生物堿及核苷類成分的定量分析研究[D].合肥：安徽中醫藥大學，2018.

[6] 彭銳，譚均，馬鵬，等.太白貝母生物堿的HPLC指紋圖譜研究[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2015，17（1）：152-155.

[7] 車朋，劉久石，齊耀東，等. UPLC-ELSD同時測定貝母類藥材中6種生物堿的含量[J].中國中藥雜志，2020，45（6）：1393-1398.

[8] 李雁群，吳鴻.藥用植物生長發育與有效成分積累關系研究進展[J].植物學報，2018，53（3）：293-304.

[9] 王紅博，唐芳，劉美麗，等.正交設計太白貝母粗多糖的不同提取工藝[J].實驗科學與技術，2016，14（1）：8-10，22.

[10] 汪少華，喬家法.不同產地浙貝母多糖含量的比較[J].中國現代應用藥學，2014，31（10）：1256-1258.

[11] 劉杰書.湖北貝母的本草考證及其品質評價[J].湖北中醫雜志，2001，23（7）：50-51.

[12] 趙倩，李波，沈瑩，等.不同規格平貝母止咳 祛痰 抗炎的藥效研究[J].中國現代中藥，2020，22（9）：1475-1477，1484.