HPLC法檢測膏藥中硫酸阿托品含量方法的建立

吳春燕 張立軍 張新玥 張轉平*

1. 陜西省安康市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 安康 725000；2.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029

止痛膏為《中華人民共和國藥典》2010、2015、2020年版收載的制劑，主要以止痛流浸膏、水楊酸甲酯、薄荷腦、冰片、蕓香浸膏、顛茄浸膏等七味藥為原料，另加基質制成膏藥。具有祛風濕、活血止痛等功效。用于風濕性關節炎、肌肉疼痛、關節腫痛等病癥[1-3]，是國家基本用藥目錄收載品種[3- 4]。顛茄浸膏為止痛膏的重要組成部分，具有抗膽堿、解除平滑肌痙攣、抑制腺體分泌的作用，可用于胃及十二指腸潰瘍，胃腸道、腎、膽絞痛等，外用可解除肌肉痙攣，從而達到止痛的效果，是止痛外用膏藥的主要成分。而硫酸阿托品是顛茄浸膏指標性成分和功效成分[5-7]。《中華人民共和國藥典》(2015年版及2020年版)收載止痛膏藥品中只見硫酸阿托品薄層鑒別，不能很好控制企業生產的膏藥質量[3, 8-10]。顛茄浸膏藥性俊烈，具有一定的毒性，與諸多藥品具有使用配伍禁忌，有必要對其進行質量控制[11]。市場膏藥質量參差不齊，不同生產廠家的止痛膏藥樣品中硫酸阿托品含量差異較大，存在非法或超劑量添加等情況，有必要提升控制標準，建立其含量測定控制線，保證膏藥質量與患者用藥安全。《中華人民共和國藥典》(2015年版和2020年版)中僅對膏藥進行了薄層色譜鑒別，難以控制其質量。本次研究，對止痛膏中硫酸阿托品進行了提取分離、含量測定，以期對市售止痛膏藥品進行質量控制。該方法操作簡便，結果準確，可為市售膏藥質量控制提供思路。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，LC Solution色譜工作站；Phenomenex ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；硫酸阿托品購自中國藥品生物制品檢定所(供含量測定用，批號100040-201312)，乙腈為色譜純，水為超純水，三氯甲烷、磷酸二氫鉀、三乙胺、磷酸、氨水均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Phenomenex ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液(取6.8 g磷酸二氫鉀溶于1000 mL水中，加入10 mL三乙胺，用磷酸調節pH值至2.8)(7∶93)為流動相等度洗脫，流速為1 mL·min-1，檢測波長為210 nm，柱溫40 ℃，進樣體積10 μL。在上述色譜條件下樣品中硫酸阿托品與其它組分分離較好，結果如圖1所示。

A.空白溶劑；B.硫酸阿托品對照品；C.傷濕止痛膏樣品圖1 HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液的制備 取硫酸阿托品對照品約20 mg，精密稱定，置20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濃度為0.882 0 mg/mL備用，存貯于4 ℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取溶劑的選擇 止痛膏中膏藥一般用三氯甲烷或乙醚提取[3,12-13]。取樣品(陜西東科，批號：150708)適量，2份(片)，分別加入三氯甲烷、乙醚洗盡布襯膏藥，再用0.5%硫酸溶液提取4次，合并酸液，再用氨水調至PH為10～11，再分別用三氯甲烷、乙醚萃取4次，水浴蒸干，用流動相定容，過濾，按“2.1”色譜條件進行分析，測定峰面積，結果顯示，相比于三氯甲烷處理，乙醚萃取轉移率較低，故選用三氯甲烷處理，見表1。

表1 兩種不同溶劑對樣品中硫酸阿托品提取的影響

2.3.2 酸提與堿沉次數的選擇[14-17]取樣品(陜西東科，批號：150708)適量，分成8份(片)，加入三氯甲烷洗盡布襯膏藥，分別置分液漏斗中。用0.5%硫酸溶液振搖提取，每次40 mL，考察提取次數(2、3、4次)，合并提取液，置分液漏斗中(酸提)。再用氨水調至PH為10～11，分別用三氯甲烷振搖萃取，每次40 mL，考察萃取次數(2、3、4次)，合并萃取液，分別置于蒸發皿中水浴蒸干(堿萃)。殘渣加流動相溶液定容10 mL容量瓶中，按“2.1”色譜條件進樣分析，分別測定峰面積。結果顯示，0.5%硫酸溶液提取3次調堿后三氯甲烷萃取4次，樣品中硫酸阿托品轉移率為98.00%(631871/644767)；0.5%硫酸溶液提取3次調堿后三氯甲烷萃取3次，樣品中硫酸阿托品轉移率為97.84%(618212/631871)，見表2。故選擇用0.5%硫酸溶液提取3次,調堿后三氯甲烷萃取3次即可。

表2 不同提取次數對樣品中硫酸阿托品提取的影響

2.3.3 供試品溶液的制備 綜上分析，收集不同廠家生產的膏藥，做好標記，剪去適量面積(cm2)，平行2份。加入三氯甲烷洗盡布襯膏藥，置分液漏斗中，分別用0.5%硫酸溶液提取3次，每次40 mL，合并酸溶液，用氨水調至PH為10～11，置分液漏斗中，再用三氯甲烷萃取3次，每次40 mL，合并三氯甲烷萃取液，水浴蒸干，用流動相定容至10 mL量瓶中，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察 精密吸取硫酸阿托品對照品儲備溶液(0.882 0 mg/mL)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL，用甲醇溶解定容至5 mL，搖勻。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，以峰面積Y對進樣量X作標準曲線，計算回歸線方程為Y=1×107X+5357.9，r=0.9991，結果表明硫酸阿托品在0.088 2 ～0.882 0 μg范圍內具有良好的線性。

2.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液(陜西東科，批號150708)，按“2.1”項下色譜條件下連續進樣6次，測定硫酸阿托品的峰面積，計算其RSD為1.07%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定試驗 精密吸取同一供試品溶液(陜西東科，批號150708)，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、3、6、9、12、24 h進樣分析，測定峰面積，計算含量。結果表明供試品溶液在24 h內穩定，樣品中硫酸阿托品含量的RSD為1.75%(n=6)。

2.7 重復性試驗 取同一批樣品6份(陜西東科，批號150708)，按“2.3.3”項下供試品溶液的制備方法和“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算含量。結果表明，本法有良好的重復性，樣品中硫酸阿托品含量的RSD為1.45%(n=6)。

2.8 回收率試驗 取已知含量的同一批(陜西東科，批號：150708，含量為0.38 mg/100 cm2)樣品適量，平行6份，分別加入硫酸阿托品對照品約0.50 mg(對照品儲備液500 μL)，按“2.3.3”項下供試品溶液的制備方法和“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算回收率(%)，平均回收率為95.73%，RSD為0.39%，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗 (n=6)

2.9 不同廠家膏藥中硫酸阿托品含量測定 取不同廠家止痛膏供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算不同廠家止痛膏藥中硫酸阿托品的含量。結果顯示，不同廠家生產止痛膏樣品中硫酸阿托品含量差異較大，含量范圍在0.06～0.39/100 cm2，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 樣品處理考察 本次研究分別考察了不同提取溶劑、萃取次數及溶劑用量對止痛膏中硫酸阿托品提取結果的影響。結果發現采用三氯甲烷萃取轉移率優于乙醚，可能是因為乙醚萃取時容易產生乳化現象，造成成分萃取不完全；乙醚容易揮發、易爆及危險系數高，最終決定采用三氯甲烷作為提取和萃取溶劑[13, 17]。同時也考察了提取與萃取溶劑用量、萃取次數及PH對樣品中硫酸阿托品轉移的影響，最終優選出上述樣品處理方法。

3.2 色譜條件考察 實驗分別考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸緩沖鹽溶液、乙腈-磷酸緩沖鹽溶液，柱溫分別考察了30、 40 ℃對分離效果的影響，最終優選出色譜條件為乙腈-磷酸緩沖鹽溶液等度洗脫(7∶93)，流速為1 mL·min-1，檢測波長為210 nm，柱溫40 ℃，分析時間50 min。

3.3 耐用性與重現性考察 在上述優選的條件下，分別考察了不同品牌的C18色譜柱(Phenomenex ODS C18、DiKMA spursil C18及Agilent ZORBAX SB-C18)、高效液相色譜儀(安捷倫與島津)及更換不同的分析人員在不同的實驗室(化學室與中藥室)對含量測定結果的影響，結果顯示新建立的止痛膏中硫酸阿托品含量測定方法耐用性及重現性均很好，RSD均小于3%。

3.3 回收率實驗結果分析 通過加入對照品回收實驗分析，平均回收率為95.7%，RSD為0.39%，結果顯示優選的方法具有很好的回收效果。

3.4 膏藥中硫酸阿托品含量測定方法小結 本研究采用溶劑萃取技術處理不同膏藥樣品，得含量測定分析提取物，通過對提取溶劑選擇、酸提堿沉次數及溶劑用量等進行考察，結果顯示，該方法被測成分硫酸阿托品轉移率高，轉移率為97.84%(618212/631871)建立了膏藥樣品處理方法。采用HPLC法建立膏藥中硫酸阿托品含量測定方法，通過專屬性、精密度、穩定性、重復性實驗以及耐用性與重現性考察，該法簡便、準確、靈敏度高，重現性好，可以用于止痛膏藥中硫酸阿托品含量測定及質量控制。本次實驗測定數據顯示，不同生產廠家的止痛膏藥樣品中硫酸阿托品含量差異較大，顛茄浸膏/流浸膏作為止痛膏重要組成部分，其硫酸阿托品為顛茄浸膏/流浸膏主要指標和功效成分，建立膏藥中硫酸阿托品含量測定方法可以很好的用于膏藥質量控制。