Ca2＋對植物乳桿菌LIP-1冷凍干燥抗性的影響及其在熱飲中的應用

滿都呼，薛舒苑，劉嘉媛，修玉鳳，馬思楠，劉澤西，王俊國

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

益生菌是一類通過改善宿主體內微生態平衡，進而促進宿主健康的微生物[1]。現在市面上的益生菌制劑多采用真空冷凍干燥法制備，因為真空冷凍干燥法制備的益生菌具有活菌數較高、保質期較長和運輸成本較低的特點，所以該技術常應用于工業生產中[2]。凍干過程中不可避免會造成菌體損傷，導致菌株失活，影響產品 性能[3]。目前的研究表明，改變培養基成分能夠有效提高菌株的冷凍干燥存活率。Li Chun等[4]的研究發現，改變培養基中碳源成分能夠提高保加利亞乳桿菌的冷凍干燥存活率。楊弋[5]的研究發現，將鎂離子加入培養基能夠增強菌株的耐熱能力。Schindler等[6]的研究證明，加入鈣離子能夠提高保加利亞乳桿菌的冷凍干燥抗性。

益生菌制劑的使用溫度有嚴格限制，目前市場上80%的益生菌制劑需用40 ℃以下的溫水沖泡，超過45 ℃，產品活菌數大幅度降低，最終影響產品的益生特性[7]。因此如何提高益生菌制劑在熱飲中的活菌數成為科研人員開發益生菌及其相關制品時的重點研究內容。

目前關于提高凍干菌粉在熱飲中存活率的研究近乎空白，因此，為提高菌株的冷凍干燥抗性和耐熱性，本研究以1 株具有降血脂益生功能的植物乳桿菌LIP-1為研究對象，通過在培養基中添加不同濃度的CaCl2，探究 Ca2+對菌株冷凍干燥抗性和耐熱性的影響，最后比較未加鈣菌粉、加鈣菌粉和未加鈣市售菌粉在不同熱飲中的活菌數，并探究內在機制，為提高益生菌制劑在熱飲中的存活率提供理論基礎與數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取分離自新疆自然發酵酸馬乳、擁有良好耐酸耐膽鹽特性和較強降膽固醇活性的植物乳桿菌LIP-1（Lactobacillus plantarumLIP-1）為研究對象，該菌株由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供[8]。

熱飲選擇市面常見的6 類飲品：阿薩姆奶茶 統一企業中國控股有限公司；礦泉水、東方樹葉茶飲料 農夫山 泉股份有限公司；原味咖啡 雀巢公司；美汁源橙汁 可口可樂（中國）投資有限公司；利樂無菌包純牛乳 伊利集團；菌粉（配料：食用玉米淀粉、白砂糖、低聚果糖、脫脂乳粉、植物乳桿菌，活菌數1010CFU/g） 市售。

無水CaCl2（分析純） 天津永晟精細化工有限 公司；青霉素G（色譜純） 北京索萊寶科技有限公司； 正己烷（色譜純） 天津福晨化學試劑有限公司；甲醇（色譜純） 天津光復科技發展有限公司；質量分數30%甲醇鈉溶液（色譜純）、氯仿（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DF-101S磁力攪拌水浴鍋 鄭州予華儀器制造有限公司；移液槍、Centrifuge-5810R高速離心機 德國Eppendorf公司；MLS-3750滅菌鍋、STAC-S45F恒溫培養箱 日本三洋公司；ZHJH-1214B超凈工作臺 南京依貝儀器設備有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機 北京 博醫康實驗儀器有限公司；DW-86L388J醫用低溫保 存箱 青島海爾特種電器有限公司；MOV-212S干熱滅菌箱 日本松下公司；ND100-1干式氮吹儀 南京肯凡電子科技有限公司；Technologies 6850氣相色譜儀 安捷倫科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將植物乳桿菌LIP-1以體積分數2%接種量接種于MRS液體培養基，于37 ℃培養箱中培養18 h，連續培養3 代，將活化的菌株置于4 ℃保存備用。

MRS培養基配制：大豆蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、無水乙酸鈉10.0 g、無水磷酸氫二鉀2.0 g、五水硫酸錳0.05 g、七水硫酸鎂0.2 g、吐溫-80 1.0 g、檸檬酸鈉2.0 g、蒸餾水1 000 mL，將上述試劑充分混勻，121 ℃滅菌15 min；MRS固體培養基在MRS的基礎上添加1%瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 Ca2+對植物乳桿菌LIP-1生長的影響

分別將0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L CaCl2加入到MRS液體培養基中，配制成不同Ca2+濃度的培養基。將活化好的菌株以4%接種量接入Ca2+培養基中，于37 ℃培養箱中培養18 h，將培養好的菌株采用稀釋平板計數法計算活菌數。

1.3.3 真空冷凍干燥

將Ca2+培養基中收集的0.1 g菌泥中加入2 mL滅菌脫脂乳，充分混勻后置于-80 ℃超低溫冰箱中預凍24 h。預凍后的樣品置于真空冷凍干燥機中凍干，凍干條件：冷阱溫度-45 ℃，真空度20 Pa，凍干時間24 h。采用稀釋平板計數法計算凍干菌粉活菌數。冷凍干燥存活率按式（1）計算。

式中：A1為經真空冷凍干燥后活菌數/（108CFU/mL）；A2為真空冷凍干燥前活菌數/（108CFU/mL）。

以凍干菌粉活菌數與冷凍干燥存活率為指標篩選 Ca2+最佳添加濃度。

1.3.4 最佳濃度Ca2+對凍干菌粉耐熱性的影響

菌株熱致死處理指的是在一定溫度、時間條件下處理后菌株存活率低于10%的處理[9]。植物乳桿菌LIP-1的熱致死溫度為75 ℃，熱致死時間為30 s[10]。首先對菌株進行熱致死處理，評價最佳濃度Ca2+對凍干菌粉耐熱性的影響。以篩選出的最佳濃度Ca2+組為實驗組，以未添加Ca2+組為對照組，將2 組凍干菌粉用生理鹽水等體積復溶，置于75 ℃水浴鍋中30 s熱致死處理后，進行平板計數。

1.3.5 菌粉在不同熱飲中耐熱存活率的測定

以最佳濃度Ca2+培養的植物乳桿菌LIP-1制備的加鈣凍干菌粉（實驗組）、未加鈣菌粉（對照組）和市售菌粉為實驗對象，每組取0.1 g菌粉，分別添加到5 mL 55 ℃礦泉水、咖啡、果汁、牛乳、奶茶和茶飲料中，在熱飲適口溫度（55 ℃）下水浴加熱5 min，通過平板計數法測定各組菌粉的活菌數，并計算實驗組與對照組菌粉的耐熱存活率。耐熱存活率按式（2）計算。

1.3.6 細胞損傷評價

采用青霉素G和NaCl敏感性實驗對3 組菌粉進行細胞壁和細胞膜損傷評價[11]。所有敏感性實驗均采用植物乳桿菌LIP-1的NaCl及青霉素G最低抑菌濃度。NaCl-MRS選擇性固體培養基即MRS培養基中添加0.5 mol/L NaCl，121 ℃滅菌15 min；青霉素G-MRS選擇性固體培養基即MRS培養基121 ℃滅菌15 min后，添加7.5 μg/L青霉素G（已過濾滅菌）。

1.3.7 細胞膜脂肪酸的測定

參考Bligh等[12]的方法。用5 mL無菌去離子水對3 組菌粉進行復溶，然后使用5 mL生理鹽水洗菌3 次（4 000 r/min、4 ℃、5 min）；稱取洗后的菌泥0.5 g，加入1.9 mL氯仿-甲醇（體積比1∶2）溶液，連續振蕩15 min，再加入氯仿及去離子水各0.625 mL，再次振蕩15 min，將混合均勻的樣品在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min；吸取下層液相，轉移至無菌離心管中，氮吹至干，再加入1 mL 1 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液，冰浴后振蕩5 min；最后加入0.625 mL正己烷振蕩混勻，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min，吸取上清液，使用有機濾膜將液體移入氣相色譜進樣瓶中。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細管色譜柱（60 m×0.25 μm，0.25 mm）；進樣口溫度250 ℃；檢測口溫度260 ℃；氮氣分流比5∶1，流速1 mL/min；柱溫程序：初始溫度80 ℃，升溫速率6.5 ℃/min，升至170 ℃，升溫速率轉為27.5 ℃/min，升至215 ℃保持2 min，升溫速率再轉為40 ℃/min，升至230 ℃保持2 min；進樣量3 μL。采用峰面積歸一法計算脂肪酸相對含量。

1.4 數據處理

實驗均平行測定3 次，結果表示為平均值±標準差。應用SPSS軟件進行顯著性分析，并使用Origin 2018與Excel軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Ca2+對植物乳桿菌LIP-1活菌數及冷凍干燥存活率的影響

由圖1可知，不同濃度Ca2+對植物乳桿菌LIP-1的活菌數與冷凍干燥存活率有不同影響。未添加Ca2+的對照組活菌數為（9.53±0.03）（lg（CFU/mL）），當Ca2+濃度達到0.5 mmol/L時，菌株的活菌數最高，達到（9.61±0.03）（lg（CFU/mL）），顯著高于對照組 （P＜0.05）。隨著Ca2+濃度高于0.5 mmol/L，菌株的活菌數逐漸降低。冷凍干燥存活率方面，與對照組相比，添加Ca2+組冷凍干燥存活率均顯著提高（P＜0.05），且隨Ca2+濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，Ca2+濃度為1.0 mmol/L時達到最高。但與菌株活菌數結合考慮，Ca2+濃度為0.5 mmol/L時，冷凍干燥后具有更高的活菌數，故將Ca2+濃度0.5 mmol/L組作為最優組別。

圖1 不同濃度Ca2＋對植物乳桿菌LIP-1活菌數與冷凍干燥存活率的影響Fig. 1 Effect of different concentrations of Ca2+ on the viability and freeze-drying survival of Lactobacillus plantarum LIP-1

2.2 最佳濃度Ca2+對凍干菌粉耐熱性的影響

為進一步探究Ca2+對菌株耐熱性的影響，本研究選取活菌數與冷凍干燥存活率均為最高的0.5 mmol/L Ca2+組為實驗組，以未添加Ca2+為對照組。首先通過熱致死實驗來判斷對照組與實驗組菌株是否具有耐熱性。

由圖2可知，未添加Ca2+的對照組熱致死處理后的活菌數為（8.26±0.12）（lg（CFU/mL）），而添加Ca2+的實驗組經過熱致死處理后活菌數為 （8.95±0.18）（lg（CFU/mL）），顯著高于對照組 （P＜0.05），證明培養基中添加Ca2+能夠提高植物乳桿菌LIP-1的耐熱性。

圖2 最佳濃度Ca2＋菌粉熱致死前后的活菌數Fig. 2 Viable counts of freeze-dried cells of LIP-1 with added Ca2＋ at optimized concentration before and after thermal treatment

2.3 菌粉在不同熱飲中的耐熱性評價

盡管現階段實驗證明，加入Ca2+培養的植物乳桿菌LIP-1具有一定的耐熱性，但其能否在各類熱飲中維持較好的耐熱性和存活率，仍需要通過實驗來驗證。

由于飲用水溫過高會燙傷食道黏膜[13]，同時本實驗室前期研究發現，大眾對55 ℃左右熱飲的接受程度最高，因此將實驗組、對照組和市售菌粉分別添加到55 ℃的礦泉水、茶飲料、咖啡、果汁、奶茶和牛乳中保持5 min，得出各組菌粉在不同熱飲中的活菌數。由圖3可知，在上述6 類熱飲中，3 組菌粉活菌數出現了同樣的變化趨勢，實驗組的活菌數均顯著高于對照組和市售菌粉組（P＜0.05），說明0.5 mmol/L Ca2+的加入能夠有效提高菌粉在各類熱飲中的存活率。

3 組菌粉在礦泉水中的活菌數最低，這是由于礦泉水中缺乏保護物質，不能在熱處理時為菌株提供更好的環境，導致菌體大量死亡[14]；茶飲料中3 組菌粉的活菌數顯著高于礦泉水（P＜0.05），這可能是因為茶飲料中的茶多酚在一定程度上減輕了菌株受到的熱損傷[15]；3 組菌粉在咖啡和果汁中的活菌數顯著高于礦泉水和茶飲料（P＜0.05），這可能是因為咖啡和果汁中含有大量糖類物質，能夠在一定程度上對菌株起到保護作用[16]； 3 組菌粉在奶茶和牛乳中活菌數顯著高于其他組別 （P＜0.05），這可能是由于這2 種熱飲中富含蛋白質、脂質和糖類，能夠對菌株起到較好的保護作用[17]。

上述實驗中發現，3 組菌粉在礦泉水中的活菌數顯著低于其他組（P＜0.05），因此選擇礦泉水進行后續實驗，可以排除糖類、脂質和蛋白質類等物質對菌株的保護。接下來將進一步探究實驗組耐熱性提高的內在機制。首先對在礦泉水中55 ℃處理5 min的3 組菌粉進行細胞損傷評價。

2.4 3 種菌粉植物乳桿菌細胞壁和細胞膜的損傷評價

當菌株的細胞壁發生損傷時，青霉素G能夠進入細胞，導致菌株死亡；當細胞膜發生損傷時，NaCl能夠進入細胞，導致菌株死亡，因此采用敏感性實驗來判斷菌株細胞壁和細胞膜的損傷程度[18]。

由圖4可知，青霉素G敏感性實驗結果顯示，熱處理后實驗組菌粉的活菌數為（8.43±0.04）（lg（CFU/mL））， 對照組菌粉的活菌數為（8.01±0.03）（lg（CFU/mL））， 市售菌粉活菌數為（7.89±0.05）（lg（CFU/mL）），實驗組菌粉顯著高于其他2 組菌粉（P＜0.05），表明實驗組菌粉的植物乳桿菌細胞壁損傷程度較輕。NaCl敏感性實驗結果顯示，熱處理后實驗組菌粉活菌數為（8.22±0.06）（lg（CFU/mL）），對照組菌粉和市售菌粉分別為（7.67±0.05）、（7.41±0.04）（lg（CFU/mL））， 實驗組菌粉顯著高于其他2 組菌粉（P＜0.05），表明實驗組菌粉的植物乳桿菌細胞膜損傷程度較輕。由于菌粉在熱致死后對NaCl更加敏感，表明植物乳桿菌細胞膜在熱致死過程中受到的損傷更大。

圖4 3 種菌粉植物乳桿菌細胞壁與細胞膜的損傷評價Fig. 4 Evaluation of cell wall and cell membrane damage of three freeze-dried bacterial cultures

2.5 3 種菌粉植物乳桿菌細胞膜脂肪酸組成

相關研究表明，細胞膜脂肪酸是影響細胞膜完整性的關鍵因素，因此本研究對3 種菌粉植物乳桿菌細胞膜脂肪酸進行測定[19]。

當乳酸菌處于不利環境時，菌株為了維持細胞膜的完整性會改變細胞膜脂肪酸的成分及含量。乳酸菌細胞膜脂肪酸的碳鏈長短、飽和度及環丙烷脂肪酸的含量均對乳酸菌的抗逆性有影響[20]。對于3 種菌粉經熱處理后的植物乳桿菌細胞膜脂肪酸成分及相對含量，由表1 可知，實驗組菌粉月桂酸（C12:0）、棕櫚酸（C16:0）、順-9-十六碳烯酸（C16:1n-7）、硬脂酸（C18:0）、γ-亞麻酸（C18:3n-6）、反-亞油酸（C18:2n-6t）相對含量較其他2 組菌粉降低，亞油酸（C18:2n-6c）、環丙烷脂肪酸（C19cyc11）、花生酸（C20:0）、順-11,14-二十碳二烯酸（C20:2n-6）、順-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸（C20:5n-3）和順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸（C22:6n-3）相對含量與對照組相比升高。此外，在實驗組中檢測出2 組長鏈不飽和脂肪酸C20:5n-3和C22:6n-3。

表1 3 種菌粉的植物乳桿菌細胞膜脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of cell membranes of three freeze-dried bacterial cultures

實驗組菌粉的植物乳桿菌細胞膜脂肪酸不飽和度顯著高于其他2 組，表明Ca2+能夠提高菌株熱處理后的細胞膜脂肪酸不飽和度。實驗組菌粉的植物乳桿菌細胞膜環丙烷脂肪酸相對含量為（9.72±0.71）%，顯著高于其他2 組 （P＜0.05）。上述結果表明，加入適宜濃度Ca2+能夠幫助植物乳桿菌菌株調整細胞膜不飽和脂肪酸和環丙烷脂肪酸相對含量，進而提高凍干菌粉的植物乳桿菌耐熱性。

3 結 論

為提高菌株植物乳桿菌LIP-1的冷凍干燥抗性和在熱飲中的存活率，向培養基中添加不同濃度的CaCl2。結果表明：培養基中添加0.5 mmol/L Ca2+能夠提高植物乳桿菌LIP-1的冷凍干燥抗性和耐熱性；將加鈣菌粉、未加鈣菌粉和市售菌粉加入不同熱飲中進行耐熱性評價，證明Ca2+能夠提高菌株在不同熱飲中的耐熱性；對菌株進行損傷評價后發現，細胞膜損傷是菌株在熱飲中死亡的主要原因，探究內在機制發現，Ca2+能夠提高細胞膜不飽和脂肪酸及環丙烷脂肪酸的相對含量，減小細胞膜損傷，提高菌株的冷熱抗性。本研究為植物乳桿菌LIP-1凍干菌粉在熱飲中的應用提供了理論參考與數據支持。