CD38 在人狼瘡腎炎血中的表達及臨床意義

崔道林，陳春麗

（曲靖醫學高等專科學校基礎醫學院，云南曲靖 655000）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種機制不詳的自身免疫性疾病，其主要特征是存在致病性自身抗體、免疫失調和慢性炎癥〔1〕。中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等免疫細胞的浸潤，可導致全身各組織和器官受損，以腎損傷為主。狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）是一種腎小球腎炎，是SLE 常見且最嚴重的并發癥之一，也是SLE 患者發病和死亡的主要原因。LN 與先天性免疫和固有免疫的過度激活密切相關，血液中除有豐富的中性粒細胞外，還有T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、單核細胞、漿細胞等免疫細胞，這些細胞與先天性免疫和固有免疫關系密切。因此，血液是尋找人LN 生物標志物的理想來源。

CD38 是一種多功能單鏈Ⅱ型的跨膜蛋白，該蛋白具有胞外酶和細胞受體功能。在淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK cell，簡稱“NK 細胞”）等免疫細胞中廣泛表達〔2〕。CD38 可以催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD） 生成環二磷酸腺苷核糖（cyclic adenosine diphosphate ribose，cADPR），接著催化cADPR 生成二磷酸腺苷核糖（adenosine diphosphate ribose，ADPR）〔2〕。cADPR 作為信號傳導介質，不但可以控制中性粒細胞、樹突狀細胞的定位和遷移運動〔3-4〕，而且是T 淋巴細胞活化和分化的調節劑〔5〕。CD38及其配體CD31 之間的相互作用，參與調節淋巴細胞與內皮細胞的黏附〔6〕。CD38 可以與多種免疫細胞形成橫向交聯，例如T 淋巴細胞的TCR/CD3 復合物，膜型免疫球蛋白，巨噬細胞的MHCⅡ類分子，B 淋巴細胞的CD19/CD81 復合物〔7-8〕。CD38 不僅可以識別T 淋巴細胞抗原受體（TCR）來調整抗原介導的T 淋巴細胞反應〔9〕，還可以識別B 淋巴細胞抗原受體（BCR）來增強B 淋巴細胞對抗原的敏感性〔10〕。由此可見，CD38 在T 淋巴細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞等免疫細胞的生理和病理環境中均起著重要作用，推測CD38 可能與人LN 密切相關。

人LN 的早期準確診斷和迅速治療對疾病進展至關重要。如果疾病癥狀能夠得以緩解，10年存活率將從46% 提高至95%〔11〕。理想的生物標志物，不僅有助于疾病的早期準確診斷和迅速治療，還有助于探尋特異性生物制劑的有效靶點。在本研究中，利用GEO（Gene Expression Omnibus）數據庫，分析CD38 在人LN 血液中的表達及臨床意義，預測CD38 參與人LN 的信號通路，旨在鑒定人LN 新的生物標志物。

1 材料和方法

1.1 數據來源 通過GEO 數據庫下載基因芯片GSE72747， 輸 入 類 型“Series”， 種屬為“Homo sapiens”，研究類型為“Expression profiling by array”，數據注釋平臺為GPL570。免疫治療前，LN 患者血樣10 例（GSM1869396，GSM1869399，GSM1869402，GSM1869405，GSM1869408，GSM1869411，GSM1869414，GSM1869417，GSM1869420，GSM1869423）；免疫治療后3 個月LN 患者血樣10 例（GSM1869397，GSM1869400，GSM1869403，GSM1869406，GSM1869409，GSM1869412，GSM1869415，GSM1869418，GSM 1869421，GSM1869424）；免疫治療后6 個月LN 患者血樣10 例（GSM1869398，GSM1869401，GSM1869404，GSM1869407，GSM1869410，GSM1869413，GSM 1869416，GSM1869419，GSM1869422，GSM1869425）。

1.2 基因表達差異分析 從GEO 數據庫下載GSE72747 芯片的“Series Matrix File（s）”和數據注釋平臺GPL570 的文件，將探針信息轉變成基因名稱，用基因表達矩陣提取CD38 表達數據。利用R語言引用“limma”數據包，分析LN 未治療組和治療組的表達差異并進行可視化。利用“strawberry－perl－5.32.0.1” 處理同一病人未治療和已治療的配對信息，運用R 語言生成配對差異圖。

1.3 相關性分析 治療時間分為未治療、免疫抑制治療3 個月和6 個月；患者性別分為男性和女性。文件整理成：第1 列為樣品ID，第2 列為時間或性別，第3 列為CD38 基因表達量。采用Kruskal 檢驗分析CD38 與治療時間的相關性，采用Wilcox 檢驗分析CD38 與患者性別的相關性。運用R 語言將差異進行可視化。

1.4 統計學分析 利用SPSS 23.0 軟件對臨床數據進行Pearson 相關分析，篩選與CD38 相關性顯著的臨床數據。臨床數據包括：SLEDAI 評分、ds DNA 抗體、腎小球濾過率等。對相關性顯著的臨床數據進行多元線性回歸分析，自變量包括ds DNA 抗體、腎小球濾過率和CD38；因變量為SLEDAI 評分（連續數值型變量）。

1.5 CD38 基因GSEA 富集分析 采用GSEA 4.1.0軟件對CD38 進行富集分析，根據GSE72747 中CD38 表達的平均值將CD38 表達分為高表達組和低表達組。關鍵參數設置：置換次數為1000；基因集數據庫為c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt［Curated］；P < 0.05 為顯著富集基因集。

2 結果

2.1 CD38 在LN 患者血液中表達差異分析 LN 患者經過免疫治療后，血液中CD38 的表達量顯著降低（P< 0.05）；免疫治療前后配對分析顯示，相對于免疫治療前，免疫治療后血液中CD38 的表達量出現顯著性下調（P< 0.05）。見圖1。

圖1 CD38 在LN 患者血液中表達差異分析

2.2 CD38 與治療時間和患者性別的相關性分析隨著免疫治療時間的延長，LN 患者血液中CD38 的表達量顯著下調（P< 0.05）；不同性別的LN 患者，血液中CD38 的表達量無顯著性差異（P= 0.554）。見圖2。

圖2 CD38 與治療時間和患者性別的相關性分析

2.3 臨床病理特征的Pearson 相關性分析 CD38的表達量與ds DNA 抗體和SLEDAI 評分相關性顯著（P< 0.05），CD38 的表達量與腎小球濾過率弱相關（相關系數r > 0.3）。見表1。

表1 臨床病理特征的Pearson 相關性分析（n=30）

2.4 臨床病理特征的多元線性回歸分析 該模型通過F 檢驗，差異具有統計學意義（P < 0.05）。D－W值為1.596，接近2，表明該模型不存在自相關性。方差膨脹系數（variance inflation factor，VIF）小于5，說明自變量之間不存在多重共線性。CD38 與SLEDAI評分呈正相關（P < 0.05），ds DNA 抗體與SLEDAI評分相關性不顯著（P = 0.74），腎小球濾過率與SLEDAI 評分相關性不顯著（P = 0.322）。見表2。

表2 臨床病理特征的多元線性回歸分析

2.5 CD38 基因GSEA 富集分析 對LN 患者免疫治療后CD38 表達量下調的可能機制進行初步分析。CD38 低表達樣本主要富集在絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）信號通路、Wnt 信號通路、JAK－STAT 信號通路、脂肪細胞因子信號通路、多糖生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝。見表3。

表3 CD38 基因GSEA 信號通路富集分析結果

3 討論

本研究分析了CD38 在LN 患者血液中的表達差異，結果顯示LN 患者免疫治療后，血液中CD38的表達量呈現顯著性下調，提示CD38 的表達量與人LN 密切相關，CD38 參與了人LN 的發病機制。一般認為人LN 的發生與免疫復合物（immune complex，IC）有關，因為幾乎所有SLE 患者腎臟都發現了IC 沉積物〔12〕。然而，沉積IC 不足以驅動人LN 的發展，還涉及其他病理因素〔13〕。LN 患者腎臟的組織病理學數據表明，腎臟內發生的炎癥是免疫失調的縮影，實質細胞和白細胞之間的相互作用決定了腎臟損害的程度〔14〕。中性粒細胞胞外陷阱在先天免疫反應中起關鍵作用，并且它們還調節適應性免疫反應〔15〕。巨噬細胞、B 淋巴細胞、樹突狀細胞、T 淋巴細胞、中性粒細胞浸潤腎組織，可導致腎臟的損失〔14〕。CD38 對中性粒細胞和樹突狀細胞的遷移很重要〔3-4，16〕。B 淋巴細胞是人LN 有希望的治療靶標，因為它們是發病機制的關鍵〔17〕。B 淋巴細胞的致病作用不僅限于自身抗體的產生，還擴展到抗原呈遞，T 淋巴細胞活化，樹突狀細胞成熟的調節以及細胞因子的分泌。隨著B 淋巴細胞的發育成熟，CD38 的表達量逐漸增加。CD38 刺激B 淋巴細胞的成熟需要磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、布魯頓酪氨酸激酶（Bruton′s tyrosine kinase，BTK）、Src 家族激酶（Src family kinase，SFK）和胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的參與〔18〕。CD38 依賴PI3K、BTK 和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活核因子κb（nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）〔19〕，從而促進B 淋巴細胞向漿細胞分化，漿細胞能分泌形成IC 的自身抗體。以上證據表明，CD38 促進SLE 轉化為LN 或加重其癥狀。

隨著治療時間的增加，血液中CD38 的表達量逐漸降低，與LN 患者癥狀減輕一致。因此，CD38 的表達量可衡量人LN 免疫治療的效果。研究表明，ds DNA 抗體除了形成IC 外，還可以上調腎細胞中與炎癥和纖維化有關的基因，導致腎臟的炎癥和纖維化，從而促進人LN 的發病或加重其臨床癥狀〔20-21〕。SLEDAI 評分是經驗豐富的臨床醫師對狼瘡疾病活動進行評估的有效模型，代表了狼瘡研究領域專家組的共識〔22〕。表2 結果顯示CD38 的表達量顯著影響SLEDAI 評分。因此，CD38 可作為LN 患者早期診斷或癥狀輕重的生物標志物。

免疫系統自我耐受性喪失，自身反應性T 淋巴細胞和B 淋巴細胞被異常激活，大量促炎細胞因子的產生，這些細胞因子對組織損傷和局部炎癥起引發或放大作用〔23〕。研究表明，MARK 信號通路、Wnt信號通路和JAK-STAT 信號通路參與人LN 發病的分子機制〔24〕。表3 結果表明，CD38 可調節MARK信號通路、Wnt 信號通路和JAK-STAT 信號通路，抑制促炎細胞因子的生成，從而特異性地預防腎損失。

綜上所述，本研究運用生物信息學方法分析LN 患者免疫治療前后血液中CD38 表達量的差異。Pearson 相關性分析和多元線性回歸分析表明CD38可作為人LN 早期診斷或治療的生物標志物。GSEA富集分析結果顯示CD38 通過MARK 信號通路、Wnt 信號通路和JAK-STAT 信號通路參與人LN 的發病機制。