果蔬汁中多酚介導的非酶褐變研究進展

楊子涵，陳丹丹，季俊夫，陳 芳，廖小軍，吳繼紅，馬玲君，胡小松

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，北京 100089）

我國果蔬汁產業起步較晚，20世紀80年代果蔬種植面積開始增大，果蔬汁產業有了充足的原材料。20世紀90年代我國果蔬汁產業迅速發展，濃縮蘋果蔬汁、梨汁出口量均排在世界第一位。但我國果蔬汁產業與發達國家仍有一定距離，因此提升果蔬汁的品質迫在眉睫[1]。果蔬汁的加工過程當中，影響果蔬汁產品品質的三大主要技術問題：果蔬汁的褐變、果蔬汁的后渾濁、果蔬汁的二次渾濁。對果蔬汁品質的研究最重要的就是解決果汁三大技術難題。針對果汁的渾濁問題，20世紀末時就發現采用一些先進的超濾技術，減少果蔬汁中的大分子物質，可以顯著防止果蔬汁貯藏和流通中引起果汁后混濁；對果漿進行酶解，提高出汁率的同時可以分解可溶性果膠，進而消除果膠引起的沉淀。果汁在儲存過程中面臨的另一個重大難題就是褐變問題，多酚類物質通過氧化聚合反應而引發褐變[2]。褐變會引起產品品質下降，產品貨架期縮短，如果沒有良好的解決辦法會極大程度沖擊果汁產業的發展。

目前國內外一致把多酚的氧化褐變分為酶促褐變和非酶褐變。酶促褐變是在氧氣的作用下，果蔬汁中的酚類物質經多酚氧化酶催化形成醌類物質，醌類物質自身聚合或者與蛋白質、氨基酸等大分子物質聚合生成高分子聚合物的一個過程?，F階段對于酶促褐變的研究較多，已經有較完善的解決方案，可以通過控制多酚氧化酶的活性來有效地抑制酶促褐變。常見的方法有熱處理、低pH、輻照法等[3]。此外Giner等[4]發現高壓脈沖電場可以抑制果蔬當中多酚氧化酶的活力，Gacche等[5]發現肉桂酸和谷胱甘肽同樣有抑制多酚氧化酶活性的作用。果蔬汁經過熱加工處理后，多酚氧化酶因鈍化而失去催化作用，但酚類物質受加工條件的影響相對較小且依然保持較高的化學反應活性，容易引起非酶褐變[6-7]。由于難以嚴格阻斷酚類物質與氧化物的接觸，該非酶褐變較難被控制并廣泛存在于果蔬汁加工和儲藏過程中[8-11]。

由此可知，多酚引起的非酶褐變是影響果蔬汁品質的一個重要難題，也是我國果蔬汁出口行業面臨的一個主要障礙，解決多酚引起的非酶褐變問題會對我國果蔬汁出口產業提供一些支持。因此，本文整理和綜述了近些年國內外的研究中常見多酚類物質結構、多酚非酶褐變的途徑與生成產物和影響非酶褐變的主要因素。

1 多酚的結構分類

多酚在化學上可以分為兩大類，一類是由分子骨架C6-C3-C6衍生的黃酮類物質，另一類是無C6-C3-C6骨架的非黃酮類物質[12]。黃酮類物質的C6-C3-C6骨架由一個中心的含氧吡喃環（C環）沿一個鍵與芳香環（A環）鏈接，并通過另一個單鍵與另一個芳香環（B環）連接（圖1）[13]。果蔬中常見的黃酮類物質有黃酮、黃酮醇類、黃烷醇類、花色苷等[14]。

圖1 黃酮類物質結構骨架Fig.1 Skeleton of flavonoids

1.1 黃酮類物質

黃酮是果蔬中含量較多的酚類物質，在C6-C3-C6骨架中的C環上多了一個酮基，是最基本的黃酮類物質。黃酮醇類和黃酮結構十分相似，C環上比黃酮多了一個羥基取代基。主要的黃酮醇類物質有楊梅酮、槲皮素、山奈酚、異鼠李亭等，同時C環多出的羥基（如圖R位置）可以發生糖苷化，糖苷化的形式主要包括葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖苷化等，其結構如圖2所示[15]。

圖2 常見黃酮醇類物質結構Fig.2 Structure of common flavonols

黃烷醇類主要分為單體和聚合體，單體是指黃烷-3-醇單體，它是黃烷醇類物質構成的基本骨架，與黃酮類物質骨架區別為B環上的取代基。主要的黃烷-3-醇單體有阿福豆素、兒茶素、沒食子兒茶素，其結構圖如圖3所示[16-17]。聚合體是指由黃烷醇類物質構成的縮合單寧，縮合單寧中不含有糖鍵，非常難水解。

圖3 常見黃烷-3-醇單體物質結構Fig.3 Structure of common flavan-3-ol monomers

花色苷是糖與花色素以糖苷鍵連接而成的物質，廣泛存在于植物的組織與器官當中，根據結構中B環上取代基的不同花色苷可以分為花葵素、花青素、花翠素、甲基花葵素、甲基花青素、甲基花翠素，結構圖如圖4所示[13,18]?；ㄉ赵贑環上的糖苷鍵能夠被?；ㄈ缫阴；⑾愣辊；?、咖啡?；龋┐呋筛€定的?；ㄉ辗肿覽19]。

圖4 常見花色苷的結構Fig.4 Structure of common anthocyanins

1.2 非黃酮類物質

非黃酮類物質雖然未含有C6-C3-C6的結構骨架，但它在果蔬生理生化方面起著不可或缺的作用。果蔬中常見的非黃酮類物質按結構分為羥基苯甲酸、羥基肉桂酸、水解單寧。羥基苯甲酸類物質的骨架為C6-C1，在結構中因為苯環上的取代基不同所以有很多不同的物質，果蔬中常見的羥基苯甲酸類物質有沒食子酸、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草酸、丁香酸、水楊酸等，結構如圖5所示[20-23]。

圖5 常見羥基苯甲酸類物質結構Fig.5 Structure of common hydroxybenzoic acids

羥基肉桂酸的結構骨架為C6-C3。果蔬中羥基肉桂酸的含量比羥基苯甲酸的含量多，尤其是蔬菜中羥基肉桂酸含量是羥基苯甲酸的十倍，比如咖啡酸、p-香豆酸幾乎存在于所有蔬菜中。果蔬中常見的羥基肉桂酸為綠原酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、2-羥基肉桂酸、3-羥基肉桂酸、異阿魏酸等，其結構如圖6所示[24-26]。水解單寧由酚酸及其衍生物與多元醇或葡萄糖通過酯鍵形成，屬C6-C1型酚類。根據分解產生的酚酸種類，可分為沒食子單寧、鞣酸單寧等，主要存在于核桃、石榴、牡丹等中，結構復雜多變[27]。

圖6 常見羥基肉桂酸類物質的結構Fig.6 Structure of common hydroxycinnamic acids

2 果蔬中常見的多酚

日常水果和蔬菜中都含有一定量的多酚類物質，水果和蔬菜是人類攝入多酚的主要來源，多酚對果蔬的色澤、風味產生影響的同時也會為人體健康帶來益處。果蔬中的多酚種類繁多，像蘋果、梨、獼猴桃、馬鈴薯等果蔬都含有一定量的多酚類物質。表1為常見果蔬的主要酚類化合物種類與含量，其中綠原酸、咖啡酸、兒茶素、沒食子酸、槲皮素等酚類物質廣泛存在于各種果蔬當中，起到了重要的作用[28-33]。

表1 常見果蔬中多酚Table 1 Polyphenols in common fruits and vegetables

3 多酚介導的非酶褐變

3.1 易氧化的多酚物質

多酚氧化引起的褐變嚴重影響果蔬汁的貨架期及品質，因此如何抑制褐變是果蔬汁生產的重要難題。前期研究發現多酚能否氧化取決于其結構中的B環。果蔬中常見的多酚按氧化難易程度進行分類如表2、表3所示，Ma等[34]近期研究發現含有鄰苯二酚、鄰苯三酚、對苯二酚基團的多酚容易發生氧化，因為這些基團氧化后能夠形成穩定的自由基陰離子[35]，其中鄰苯三酚比鄰苯二酚更容易發生自氧化[36]。具有這些官能團的酚類物質主要包括咖啡酸及其酯類、兒茶素、表兒茶素、花青素及其衍生物、沒食子酸和槲皮素等[37]。單酚、間苯二酚和取代酚（特別是甲氧基衍生物）不容易被氧化，因為它們不能產生穩定的半醌自由基[35,38]。此外，異構體反應活性的不同導致氧化電位的差異，也會影響多酚的氧化速率。因為鄰位和對位的電子密度最高，當苯環上的羥基位于鄰位或對位時，芳香環被羥基活化導致反應活性增強，因此，對苯二酚和鄰苯二酚的芳香環易被激活，而間苯二酚的芳香環由于電子密度低不易被激活，所以間苯二酚相對于對苯二酚或鄰苯二酚不易被氧化。對苯二酚和鄰苯二酚可以通過兩個電子和兩個質子的轉移發生可逆反應形成醌，而間苯二酚在失去兩個電子時不能產生鄰或對醌類產物[39]。

表2 易氧化的酚類結構Table 2 Easily oxidized phenolic structure

表3 不易氧化的酚類結構Table 3 Not easily oxidized phenolic structure

3.2 多酚氧化聚合引起的褐變

含鄰苯二酚基團的多酚在氧氣存在的條件下被氧化成醌，醌類物質進一步反應聚合形成黃棕色的大分子，最終導致褐變[40-41]，因此具有鄰苯二酚等結構的酚類物質是多酚非酶氧化聚合形成褐色物質的前提。酚類物質具有較高的pKa，在pH較低的果蔬汁等酸性條件下很難失去電子，從而延緩了酚類物質與O2直接反應的速率[42]。一些過渡金屬離子，尤其是鐵和銅，可以改變反應路徑，降低反應所需的自由能，從而促進多酚氧化。作為初級氧化產物，醌的形成過程十分復雜，在Fe2+存在的條件下，氧氣被連續的單電子還原產生超氧陰離子自由基，而Fe2+氧化為Fe3+[43]，超氧陰離子自由基會迅速轉化為氫過氧自由基（HOO·），鄰苯二酚基團是HOO·的主要反應底物（鄰苯三酚的反應類似），這些鄰苯二酚和鄰苯三酚基團可以通過與HOO·反應或與Fe3+配位被迅速氧化成半醌類化合物[44]，同時產生過氧化氫。生成的半醌自由基立即與氫原子等其他自由基發生歧化反應，生成新的鄰苯二酚結構或進一步氧化成醌[41-42]。

酚類的氧化偶聯是一種雙電子氧化，一般可能有外部和內部氧化兩種耦合模式。在前一個過程中，電子從酚醛基團轉移到外部氧化劑；而在后一個過程中，發生的是內部的氧化還原，其中一個部分在耦合步驟中被氧化，另一個被還原。酚類分子通過碳碳或碳氧耦合可以形成許多不同的產物，例如聚合物和醌類化合物。簡單的酚類物質通過鄰位或對位的羥基連接，以產生幾種可能的二聚體；醌-酚二聚體也可以轉化為新的雙酚二聚體，或通過兩個半醌直接形成二聚體。在氧化耦合反應中產生的二聚體或聚合物比它們的初始酚類具有更低的氧化還原電位，因此更容易氧化，從而加速酚類的聚合反應[45]，最終產生更大的聚合物，如圖7所示。

圖7 兩個半醌或醌和苯酚之間的反應再生低聚物Fig.7 Reaction between two semiquinones or quinone and phenol to regenerate oligomers

復雜的多羥基芳香化合物可能發生分子內或分子間的耦合[44]。黃酮類物質結構中含間苯二酚A環和鄰苯二酚B環兩種不同的功能基團。A環和B環不結合，一個環上的OH的電離不會顯著影響另一個環的OH的電離。Ma等[34]發現A環上的間苯二酚基團能夠通過與醌類反應來淬滅醌，生成無色的鄰苯二酚和黃酮加合物，從而防止褐變[46]。而B環上的鄰苯二酚基團可以通過氧化形成具有反應活性的褐變前體黃酮類醌。產生的黃酮類醌可進一步與另一個黃酮類化合物的A環反應，生成黃酮類化合物二聚體[47]。以兒茶素為例，兒茶素自氧化或化學氧化導致聚合物的形成，是由于一個單元的A環與另一個單元的B環之間反復的縮合反應（“頭尾”聚合機理）引起的。當兒茶素醌存在時，鄰苯二酚單元的A環的6號碳對兒茶素醌B環的親核攻擊導致脫氫兒茶素（即兒茶素二聚體）的形成，然后，B環氧化為脫氫兒茶素醌后，通過兒茶素醌為氧化劑進行偶聯氧化，脫氫兒茶素可能通過兩種不同的分子內加成反應，再經過異構化生成黃色二聚體[47]。產物具有相當數量的共軛雙鍵，提供了可見的吸光度，從而導致褐變。因此，醌類物質是褐變形成的重要前體物，如何阻止醌的形成或加速醌的消除是抑制褐變的關鍵卡脖子問題。

4 多酚介導非酶褐變的影響因素

前期研究發現，影響酚類非酶褐變的因素有很多，比如金屬離子含量、溫度、pH以及抗氧化劑。不同影響因素影響褐變的作用機理不同，可以通過影響酚類的氧化或通過與醌發生親核加成或氧化還原反應從而影響褐變程度。

4.1 金屬離子

Danilewicz等發現在酸性條件下，O2無法與酚類物質直接結合[42]。后續研究表明金屬離子如鐵離子、銅離子等在反應過程中能夠起到催化作用，促進酚類物質的氧化[35]，單獨一種金屬離子的催化作用較弱，而多種金屬離子之間的協同作用較為明顯[48]。在Danilewicz等用鄰苯二酚建立了相應的反應模型體系中，添加亞鐵離子和銅離子之前，模型當中的酚類物質不會發生顯著變化[49]；在含有亞鐵離子和銅離子葡萄酒中，添加了亞鐵氰化鉀去除金屬離子后，鄰苯二酚同樣不會發生顯著變化[50]。說明一旦體系當中缺少了鐵離子與銅離子等金屬離子的催化作用，整個反應將會減緩甚至停止。其原因主要分為兩方面，一方面O2與Fe2+反應產生氫過氧自由基，進而產生過氧化氫；另一方面Fe3+形成后與酚類物質進行螯合，酚類物質被氧化成半醌自由基和醌類物質，Fe3+則被還原成Fe2+繼續循環反應。Danilewicz等在實驗中添加了Fe2+，觀察到體系中氧氣含量下降，且隨著金屬含量的增加，氧化速度加快，確認了Fe2+和氧氣的相互作用關系[51]。

4.2 溫度

溫度是果蔬汁褐變的重要影響因素，高溫將導致醌類物質的穩定性降低，酚類物質與醌類物質之間的轉化的平衡傾斜，從而促進酚類物質的氧化。劉靜和Dong等分別在果蔬汁體系和化學氧化模型體系中進行了溫度與酚類物質氧化之間關系的研究，發現隨著溫度的升高，酚類物質的含量越來越少，酚類物質氧化加劇[52-53]。李娜研究了溫度對紅樹莓果蔬汁顏色穩定性的影響，發現溫度越高，紅樹莓果蔬汁的吸光度越大[54]，吸光度反映了果蔬汁褐變指數，褐變指數的增大表明果蔬汁當中酚類物質的氧化產物的增加。藍莓汁在不同溫度下同樣得出高溫導致非酶褐變加劇，且總酚含量減少的結果[55]。Fernandezzurbano等[56]比較了20和55 ℃下的葡萄酒的褐變程度，證明了高溫條件下葡萄酒褐變速度加快，褐變時間縮短?；谝陨涎芯坎聹y高溫影響了花色苷等酚類物質的化學氧化反應速率，促進了酚類物質的氧化，最終導致果蔬汁顏色的加深。但是，無論是藍莓汁，紅樹莓汁還是葡萄酒體系中褐變的加深，都不能完全證明溫度升高會影響酚類物質非酶氧化速率，很有可能是酶和美拉德反應的作用。未來可以單獨制作酚類物質非酶氧化的模擬體系，在排除多酚氧化酶的干擾下，在不同的溫度條件下，深入研究溫度對多酚介導的非酶褐變的影響。

4.3 pH

pH是影響多酚介導的非酶褐變的重要因素之一。Dong等[52]用不同的參數，包括pH、溫度和酚類物質，模擬了酚類物質化學氧化體系。在酚類物質被氧化以后，根據T420測定褐變程度，得到不同因素的影響能力從大到小排列為pH＞酚的種類＞溫度，證明pH在多酚氧化中的重要性。早在1989年，Cilliers等研究咖啡酸的氧化模型時發現pH的變化與酚類氧化息息相關。隨后又發現pH的升高會導致酚類氧化速率加快[57]。接下來研究當中發現酚類物質氧化速率隨pH的增加而增加，推測高pH條件下醌類物質不穩定性增加，從而導致酚類物質氧化速率的增加[48]。在模擬酚類物質氧化體系下，發現酚類化合物的氧化更容易在堿性條件下發生，該實驗結果與Dong、Hocking、胡燕等的研究結果一致[52,58-59]。這是由于酚類物質在堿性條件下，可與氧氣直接反應，酚類化合物的弱酸性特性（pKa9～10）允許它們形成能與氧反應的酚酸陰離子。從酚酸陰離子中去除一個電子會產生半醌，半醌可以不成比例地產生醌和苯酚；在中高 pH（pH7～9）時，具有鄰苯三酚單位（如表沒食子兒茶素）的酚類物質比具有簡單鄰苯二酚取代的酚類物質更容易氧化[60]；在pH＞10時，C環上的取代基可被氧化，使酚類化合物與鄰苯二酚或鄰苯三酚的反應活性平衡[36]。但是，由于果蔬汁是偏酸性的，并且多酚的pKa很高，因此果蔬汁多酚中只有一小部分會被去質子化，從而消除了這種直接的氧化途徑，如上文所述，在酸性條件下，多酚需要通過自由基和過渡金屬與氧氣進行反應。

4.4 抗氧化劑

抗氧化劑在食品中廣泛應用，Nikolantonaki等用不同親核試劑與多酚的氧化產物醌類物質發生反應，得到反應速率從小到大依次為：氨基酸＜揮發性硫醇＜抗氧化劑，說明在多酚引起的非酶褐變當中，抗氧化劑會先于酚類等親核試劑與醌發生反應，從而起到保護作用，是未來解決多酚引起的非酶褐變問題的一個方向。目前用抗氧化劑抑制多酚引起的非酶褐變問題主要在葡萄酒領域研究，其中常應用的抗氧化劑有二氧化硫、谷胱甘肽、抗壞血酸等[61]。

4.4.1 二氧化硫 二氧化硫（SO2）是一個被廣泛使用的抗氧化劑，同時具有抗微生物特性和抗氧化特性[62]。在葡萄酒中防止多酚介導非酶褐變的主要物質就是SO2。SO2在溶液中以亞硫酸氫鹽（）和亞硫酸鹽（）形式存在。亞硫酸鹽通過與O2反應阻止氧化，這種觀點已存在了多年[63]。而Danilewicz等研究發現，SO2在氧化體系中無法直接與氧氣發生反應，而是與H2O2和醌類物質發生反應；Nikolantonaki等用高效液相色譜（HPLC）發現了二氧化硫與醌類發生兩種反應：近90% SO2與醌發生氧化還原反應生成多酚，小部分SO2與醌類發生了親核加成反應，生成了三種加成產物，這三種加成產物具有相同的分子式C7H8O5S[35,44,61,64]。此外，有些葡萄酒中SO2消耗少于其他葡萄酒，說明它們中可能含有反應活性更強的還原劑，推測是抗壞血酸和亞硫酸鹽一起添加所致[44]。Nikolantonaki等也發現將谷胱甘肽與SO2結合使用可以降低SO2的添加量以及其對感官品質的負面影響，具有更強的抗氧化效果[61]。這說明SO2與其他抗氧化劑結合具有更強的協同作用。近些年來，越來越多的研究表明二氧化硫可能不是一種有效的抗氧化劑[65-66]。而且SO2能夠在特定人群體內產生過敏反應，法律上已經限制了其最高含量。未來的研究方向將使用性能相似但負面影響較小、效率較高的新化學品替代SO2[67]。

4.4.2 谷胱甘肽 谷胱甘肽（GSH）是L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的三肽。谷胱甘肽主要用做抗氧化劑、免疫增強劑和排毒劑。在過去的幾十年中，GSH一直和其他抗氧化劑協同使用，直到最近被提出作為替代SO2的抗氧化劑[68]。GSH的抗氧化機理是捕捉酚類物質生成的鄰醌而生成無色化合物，從而防止深色的醌類聚合物的生成。Nikolantonak等建立鄰苯二酚生成的醌與GSH的反應模型體系，發現他們之間發生的是親核加成反應，加成產物為一個或兩個GSH與鄰苯二酚結合的化合物，說明GSH和鄰苯二酚可以發生兩次親核加成反應[61]。Singleton等研究發現GSH和鄰醌反應生成GRP（2-S-谷胱甘肽基乙酸），是一種無色的化合物，能防止果肉褐變[69-70]。Webber等也證明了GSH阻止了兒茶素的聚合物生成，減少了褐變反應[71]。在GSH與其他抗氧化劑協同作用方面，Roussis等發現GSH與SO2同時使用能彌補SO2造成的揮發性化合物的損失[72]。Sonni等把GSH和抗壞血酸結合使用，證明在抗氧化能力上該組合比單獨使用GSH或抗壞血酸更有效[73]。已有的研究表明GSH擁有SO2的抗氧化效果。未來關于GSH作為抗氧化劑的研究領域可以更為廣泛，并逐漸的引入到果蔬汁體系當中。

4.4.3 抗壞血酸 抗壞血酸俗稱VC，具有很強的還原性，它廣泛存在于新鮮果蔬中?？箟难岷彤惪箟难崾钱悩嬻w，都具有抗氧化性。目前抗壞血酸及其異構體也被認為是優良的抗氧化劑[74]，Nikolantonak等研究表明抗壞血酸與醌類物質發生氧化還原反應，直接還原醌類物質成多酚。在反應模型中抗壞血酸不會直接與氧氣反應，它通過消耗生成的醌類物質而促進氧氣與多酚的反應，進而起到抗氧化作用[61]。但是抗壞血酸沒有抗微生物活性，這方面無法替代SO2[75]。目前抗壞血酸多用于SO2的協同劑，共同起到抗氧化作用。

5 結論與展望

果蔬中含有多種多酚，它們與果蔬汁的非酶褐變密切相關。本文系統介紹了酚類引起褐變的機理，根據酚類的不同結構和氧化的難易程度對多酚進行了分類。多酚的酶促褐變已經被廣泛研究報道，可以通過消除多酚氧化酶而抑制褐變，然而目前對于多酚氧化引起的非酶褐變及其機理的相關研究較少，尋找有效預防或者阻止多酚氧化引起的非酶褐變方法是未來果蔬汁產業亟需解決的科學問題。本文從引起酚類非酶氧化的原因及過程入手，揭示含鄰苯二酚基團的多酚與氧氣接觸后，在過渡金屬離子和自由基作用下通過電子轉移非酶氧化形成醌類物質，醌類再進一步氧化并與多酚聚合最終形成褐色物質，因此多酚氧化聚合形成具有大分子雙鍵的多酚聚合物是導致褐變的主要原因。在今后的研究中，可以從多酚氧化的源頭入手，減少易氧化的酚類物質的含量；隔絕氧氣，避免其與多酚物質接觸；剔除果蔬汁中的金屬離子等途徑，有效減緩氧化過程。同時可以從氧化過程入手，通過添加抗氧化劑將醌類還原成多酚形式，從而防止褐變；也可通過添加親核試劑將醌類物質捕獲，阻斷醌類物質的進一步反應，避免其繼續氧化聚合形成大分子聚合物。同時，溫度、pH等因素對酚類介導的非酶褐變也具有較強的影響，降低溫度及保持酸性環境可延緩多酚的非酶氧化，從而保持果蔬汁的品質。