糖苷結(jié)構(gòu)對苦蕎黃酮促進葡萄糖在C2C12小鼠骨骼肌細胞中攝取作用的影響

吳偉菁，仇 菊 ，吳蘭蘭，朱 宏，馬國宇，謝 文

（1.廈門醫(yī)學(xué)院，福建廈門 361023；2.天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建廈門 361023；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建廈門 361018；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所，北京 100081）

苦蕎 （Fagopyrum tataricum） 富含黃酮類物質(zhì)，含量為6.65～22.27 mg/g，其中蘆丁占90%以上[1-2]。雖然，苦蕎中的黃酮以蘆丁為主[3-4]。由于苦蕎含有蘆丁降解酶，蘆丁降解酶遇水可立即將苦蕎中的雙糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮-蘆丁降解為黃酮前體-槲皮素[5]。通過提前熱處理進行滅酶，能夠保護苦蕎中的蘆丁不被降解[6]。因此，不同加工順序會對苦蕎黃酮類化合物的組成產(chǎn)生影響[6]。另外，苦蕎黃酮提取物通過添加柚苷酶、高壓并加入α-L-鼠李糖苷酶，可將蘆丁轉(zhuǎn)化為單糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮-異槲皮素[7-8]。因此，對比苦蕎中蘆丁及降解產(chǎn)物之間的活性[2]（三者的結(jié)構(gòu)如圖1），有助于闡明不同加工方式對苦蕎黃酮的營養(yǎng)成分保持及功效活性的影響，進而選擇合適的苦蕎加工技術(shù)[9]。

圖1 槲皮素（Q）、異槲皮素（I）及蘆丁（R）的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of quercetin(Q), isoquercetin(I) and rutin(R)

不同糖苷結(jié)構(gòu)的苦蕎黃酮具有不同的生物活性。蘆丁及其降解產(chǎn)物（異槲皮素及槲皮素）具有抑制碳水化合物消化酶的作用[10-12]，槲皮素比蘆丁和異槲皮素具有更高的抑制活性。但在一定的濃度范圍內(nèi)，蘆丁和異槲皮素則無顯著性差異[11]。也有研究表明，槲皮素能夠直接被大鼠腸道吸收，而帶有糖苷結(jié)構(gòu)的異槲皮素和蘆丁吸收利用率較低[13]。苦蕎的蘆丁和槲皮素也具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用，且槲皮素為主要的生物效應(yīng)結(jié)構(gòu)單元[14]。但也有研究發(fā)現(xiàn)蘆丁抑制肥胖的效果顯著高于槲皮素[15]。同時，苦蕎黃酮提取物具有降血糖作用[7,16-21]。從苦蕎食品加工的角度來看，不同加工技術(shù)促使苦蕎蘆丁不同程度的轉(zhuǎn)化為槲皮素，槲皮素的苦味可令產(chǎn)品口感受到影響，這促使苦蕎脫苦、抑制蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素成為部分企業(yè)傾向于選擇的加工技術(shù)。然而，蘆丁與其前體或降解產(chǎn)物之間的轉(zhuǎn)化，對苦蕎黃酮功效活性的影響卻沒有直接報道，更缺乏關(guān)于細胞水平上作用機制的差異報道。因此，研究蘆丁及其降解產(chǎn)物的降血糖效果不僅有助于進一步揭示苦蕎黃酮的降血糖機制，而且能為苦蕎黃酮生物活性保持的加工技術(shù)提供理論依據(jù)。本研究采用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜，對苦蕎中的黃酮類化合物進行分析定量。同時基于C2C12小鼠骨骼肌細胞，從細胞水平上比較蘆丁、槲皮素、異槲皮素這三類含有不同糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮對于葡萄糖攝取的效果，并從分子水平上闡明其作用機制的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎粉（西蕎2號） 國家燕麥?zhǔn)w麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系涼山綜合試驗站；蘆丁、槲皮素、異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品

中檢所；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）細胞培養(yǎng)基及雙抗 Hycolne公司；胎牛血清、雙抗 澳洲康寧公司；馬血清 Gibco公司；2-NBDG熒光葡萄糖（2-[N-（7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑-4-基）氨基 ]-2-脫氧 D-葡萄糖） 美國 Thermo-fisher公司；胰島素注射液（40 IU/mL, 255 μmol/L） 萬邦醫(yī)藥公司；30%丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶液（29:1）儲備液、牛血清白蛋白V 北京拜爾迪生物科技有限公司；RIPA（Radio-Immunoprecipitation assay）裂解緩沖液 索萊寶科技公司；一抗（Insulin receptor substract-1（IRS-1）、AKT、phospho-AKT（p-AKT）、AMP-activated protein kinase（AMPK）、 phospho-AMPK （p-AMPK）、acetyl-CoA carboxylase （ACC）、phospho-ACC （p-ACC）、β-actin等），二抗（鼠抗IgG及兔抗IgG） 美國Cell signal Technology公司；ECL（Enhanced chemiluminescence）發(fā)光液、PVDF（polyvinylidene fluoride）膜 美國密理博公司；BCA蛋白含量測定試劑盒 美國Bigma公司；小鼠C2C12骨骼肌細胞（ATCC號：CRL-1772?） 中國科學(xué)院細胞庫；其余藥品 均為分析純。

LC-MS 8050型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、HPLC色譜柱（C18, 2 mm×7.5 mm, 1.6 μm） 日本島津公司；Infinite M200型酶標(biāo)儀 奧地利Tecan公司；電泳、Mini protean Tetra Cell轉(zhuǎn)膜裝置、 ChemiDoc XRS+凝膠成像儀 Bio-rad公司；CCL-170B-8型細胞培養(yǎng)箱、AC2-6SI型超凈工作臺 ESCO公司；3-18K型小型離心機 Sigma公司；IC1000型細胞計數(shù)器Count Star公司；DMI-300B型倒置顯微鏡 萊卡公司；細胞超聲破碎儀器 美國 Sonics公司；BSA224S型分析天平 賽多利斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎水浸泡處理及黃酮的提取 樣品處理：精密稱取5 g干燥的苦蕎全粉, 先加入蒸餾水30 mL，搖勻，室溫下使苦蕎粉與水充分接觸30 min后，再加入120 mL純甲醇，使得甲醇終體積分數(shù)為80%。另外，取干燥苦蕎粉5 g，直接加入體積分數(shù)為80%的甲醇溶液，作為水浸泡處理前的樣品。

黃酮提取方法參考文獻[7]，并做一定修改。在上述條件下，采用80 ℃回流提取2 h，抽濾獲得濾液，濾渣重復(fù)提取1次。合并兩次濾液，50 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得苦蕎黃酮提取物。隨后充分溶解并定容于100 mL甲醇，用于黃酮分析實驗。

1.2.2 苦蕎黃酮分析（HPLC/ESI/MS法） 苦蕎黃酮的分析方法參考文獻[22-23]，并做一定修改。精密稱取一定量蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液配制成一定濃度的對照液（0～1 mg/mL），以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線（蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9378.1x+1417.3，R2=0.9951；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=38465x+1401.8，R2=0.9965）。總黃酮含量為蘆丁和槲皮素總量。所有標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均通過0.22 μm微孔濾膜過濾后，取濾液進樣。HPLC條件：流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈。流速 0.25 mL/min，進樣量為 0.4 μL。流動相梯度：0～5 min，10% 乙腈；5～25 min，20% 乙腈；25～40 min，30%乙腈；40～50 min，50%乙腈。PDA檢測波長350 nm。質(zhì)譜條件如下：采用負離子全掃描；粒子源：ESI；霧化氣流：2 L/min；界面溫度：300 ℃；DL 溫度：250 ℃；曲線脫溶劑單元：400 ℃。

1.2.3 C2C12細胞培養(yǎng) C2C12細胞培養(yǎng)采用的完全培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基（高糖）+10%胎牛血清+1%雙抗，分化培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基（高糖）+2%馬血清+1%雙抗，無血清培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基（低糖）+1%雙抗。將細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d更換一次完全培養(yǎng)基，細胞生長70%進行傳代或播種。

1.2.4 C2C12細胞葡萄糖攝取實驗 葡萄糖攝取實驗參考文獻[24]，并做一定修改。將C2C12細胞播種至96孔細胞板（8000個細胞/孔），培養(yǎng)24 h后更換分化培養(yǎng)基，每隔1 d更換分化培養(yǎng)基，分化5 d后，80%～90%細胞呈現(xiàn)肌管形態(tài)后，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后進行葡萄糖攝取實驗。

將蘆丁、槲皮素及異槲皮素充分溶于10 μL的DMSO，隨后用無血清培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。陽性對照采用胰島素，將胰島素注射液采用無血清培養(yǎng)基稀釋至100 nmol/L。吸棄舊培養(yǎng)基后，加入100 μL不同濃度待測樣品，陽性對照加入胰島素，反應(yīng)30 min。對照及空白則加入無血清培養(yǎng)基。在相同培養(yǎng)時間（1 h）下，選取不同加樣濃度（10、25、50、100、200、400 μmol/L），探究不同濃度的樣品對糖吸收的影響；在相同的樣品濃度（50 μmol/L）下，選取不同培養(yǎng)時間梯度（0.5、1、3 h），探究不同培養(yǎng)時間對糖吸收的影響；將終濃度為100 μmol/L的蘆丁、槲皮素及異槲皮素樣品與終濃度為100 nmol/L的胰島素共同反應(yīng)30 min，探究樣品與胰島素的協(xié)同效應(yīng)。葡萄糖攝取采用2-NBDG法測定。樣品培養(yǎng)反應(yīng)結(jié)束后，用37 ℃預(yù)熱的KRPH緩沖液（pH7.4，118 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L KH2PO4, 1.3 mmol/L CaCl2,1.2 mmol/L MgSO4，30 mmol/L HEPES）清洗細胞1次后，加入50 μL溶于KRPH緩沖液的2-NBDG（100 μmol/L），空白孔加入KRPH緩沖液，隨后培養(yǎng)板避光放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min后。用4 ℃預(yù)冷PBS清洗細胞3次，最后加入150 μL PBS。由熒光分光光度計測定（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm）熒光強度。2-NBDG攝取率根據(jù)以下公式計算：

1.2.5 蛋白印跡法測定C2C12細胞蛋白表達 測定蛋白相關(guān)信號通路的表達量和磷酸化水平參考文獻[24]。將C2C12細胞播種于6孔細胞板培養(yǎng)，采用方法1.2.4進行分化。待細胞充分分化后，無血清培養(yǎng)12 h，將細胞與100及400 μmol/L的蘆丁、槲皮素、異槲皮素樣品反應(yīng)1 h。陽性對照采用1 μmol/L胰島素作用30 min。隨后，細胞用PBS清洗2次后，加預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液，并超聲3 s充分裂解細胞。以14000 ×g的轉(zhuǎn)速離心30 min，收集上清液，即為總細胞裂解液。按比例加入上樣緩沖液，混勻后于95 ℃加熱5 min。取20 μg蛋白/道上樣并電泳（濃縮膠 80 V，0.5 h；分離膠 120 V，1.5 h）。電泳結(jié)束，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜（100 V，1.5 h），與5%BSA封閉1 h。封閉完畢后，加入溶于5% BSA溶液的一抗（一抗稀釋比例為1:2000），4 ℃輕搖過夜。PVDF膜用TBST洗3次，每次5 min。加入溶于5% BSA的二抗（二抗稀釋比例為1:5000），室溫孵育1 h。PVDF膜用TBST洗3次。將ECL試劑盒的AB液體混合，與二抗孵育后的PVDF膜輕搖反應(yīng)30 s，將PVDF膜平鋪于凝膠成像儀中曝光。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±S.D.）表示。多組之間的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），事后比較采用Duncan分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎黃酮組成分析及水浸泡處理對黃酮的影響

苦蕎（西蕎2號）黃酮的色譜分析如圖2A所示。通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進行比對及質(zhì)譜信息，一共鑒定出4種黃酮，分別是槲皮素-蕓香葡萄糖苷、蘆丁、山奈酚-蕓香糖苷及槲皮素。其中，蘆丁和槲皮素的質(zhì)譜圖如圖2B和圖2C所示，它們的[M-H]-（m/z）分別為609及301。苦蕎中鑒定出的黃酮種類與Jiang和Li的研究結(jié)果一致[22-23]。

如圖2A及2D所示，苦蕎中的蘆丁含量為3.09%，占總黃酮的94.81%；槲皮素含量為0.26%，占總黃酮的0.84%，因而蘆丁為苦蕎黃酮的核心組成部分，與Li和Liu的報道一致[3-4]。但經(jīng)水浸泡處理后，苦蕎粉中的蘆丁幾乎全部降解為槲皮素。槲皮素含量為1.58%，而蘆丁含量可忽略不計（圖2D）。槲皮素分子量約為蘆丁的一半，因此總黃酮含量下降近一半，本結(jié)果與先前的報道一致[24-25]。

圖2 苦蕎中黃酮組成的分析Fig.2 Analysis of flavonoids extracted from tartary buckwheat

2.2 不同糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮對C2C12細胞糖攝取的影響

不同濃度的黃酮對于C2C12細胞2-NBDG吸收的影響如圖3所示。槲皮素在濃度≥50 μmol/L具有明顯促進2-NBDG攝取的作用，而蘆丁和異槲皮素在濃度≥100 μmol/L具有明顯促進糖攝取的作用。濃度≥100 μmol/L下，槲皮素促進2-NBDG攝取的效果顯著大于蘆丁和異槲皮素（P＜0.05）。在濃度100～200 μmol/L條件下，蘆丁和異槲皮素的促進糖攝取作用無顯著差別（P＞0.05）。當(dāng)濃度為400 μmol/L，異槲皮素的促進作用顯著大于蘆丁（P＜0.05）。

圖3 不同濃度的黃酮對于C2C12細胞2-NBDG吸收的影響Fig.3 Concentration-dependent effects of flavonoids on 2-NBDG uptake in C2C12 myotubes

不同反應(yīng)時間對C2C12細胞的2-NBDG攝取的影響如圖4所示。在低濃度50 μmol/L下，槲皮素反應(yīng)0.5 h則可顯著促進2-NBDG的攝取（P＜0.05），且隨反應(yīng)時間增加可增加2-NBDG的攝取。相比之下，蘆丁和異槲皮素的反應(yīng)時間達3 h才可顯著促進2-NBDG 的攝取（P＜0.05）。

圖4 不同反應(yīng)時間的黃酮對C2C12細胞的2-NBDG攝取的影響Fig.4 Time-dependent effects of flavonoids on 2-NBDG uptake in C2C12 myotubes

黃酮與胰島素協(xié)同效應(yīng)的實驗中（如圖5所示），100 μmol/L的蘆丁和異槲皮素促進2-NBDG攝取與胰島素持平，而槲皮素顯著高于胰島素刺激后葡萄糖攝取水平（P＜0.05）。這說明槲皮素促進C2C12細胞攝取葡萄糖可能存在著非胰島素依賴型的信號通路。由上述結(jié)果可獲得，苦蕎黃酮對于C2C12細胞葡萄糖攝取作用大小順序如下：槲皮素＞異槲皮素＞蘆丁。

2.3 不同糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮對C2C12細胞信號通路的影響

如圖6及圖7，通過蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)蘆丁、異槲皮素對于胰島素依賴性的信號通路（IRS-1及AKT磷酸化）無增效作用，而槲皮素會抑制IRS-1及AKT 的磷酸化。低濃度（100 μmol/L）及高濃度（400 μmol/L）的槲皮素可明顯促進AMPK及下游ACC的磷酸化，且高于蘆丁和異槲皮素。低濃度（100 μmol/L）的蘆丁和異槲皮素沒有促進AMPK磷酸化，但高濃度（400 μmol/L）的蘆丁、異槲皮素均可促進AMPK/ACC磷酸化，且異槲皮素的作用大于蘆丁。

圖6 黃酮對于C2C12小鼠骨骼肌細胞的蛋白表達的影響（代表性條帶）Fig.6 Effect of flavonoids on signal pathway of C2C12 myotubes

圖7 小鼠骨骼肌C2C12細胞蛋白表達量Fig.7 Relative protein expression of C2C12 myotubes

3 討論與結(jié)論

苦蕎黃酮中核心組成部分為蘆丁，但不同加工順序直接影響苦蕎中黃酮的組成。先與水接觸會引起苦蕎中黃酮從蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素，并且總黃酮含量下降近一半。而苦蕎中核心黃酮成分的變化對于其在細胞水平上的降血糖作用也有一定影響。蘆丁和異槲皮素在低濃度下無明顯促進葡萄糖攝取作用，隨著反應(yīng)時間增加至3 h，它們也開始具有促進葡萄糖攝取的作用。有研究表明，延長培養(yǎng)時間至24 h，低濃度（1 μmol/L）蘆丁可顯著促進大鼠骨骼肌細胞的葡萄糖攝取作用[26-27]。結(jié)合本研究說明，由于糖苷結(jié)構(gòu)替代槲皮素中的C3-OH基團，導(dǎo)致了異槲皮素及蘆丁空間結(jié)構(gòu)增大，空間結(jié)構(gòu)增大可能降低其黃酮的糖攝取活性。另外，在低濃度下，蘆丁和異槲皮素在促進葡萄糖攝取上無顯著性差異，并且不超過陽性對照胰島素（P＞0.05）。這說意味著空間效應(yīng)比替代C3-OH的引起的葡萄糖攝取變化作用小。但而隨著濃度增加至400 μmol/L，異槲皮素促進葡萄糖攝取作用顯著高于蘆丁（P＜0.05），說明了異槲皮素和蘆丁空間結(jié)構(gòu)上的差異在高濃度下可能引起糖攝取作用的差異。結(jié)果表明，槲皮素促進骨骼吸收葡萄糖效果最佳。同時，已有報道稱槲皮素在抑制碳水化合物消化酶效果顯著[10-12]。因此，在能夠接受槲皮素帶來的苦蕎食品的苦味的情況下，食用富含槲皮素的苦蕎食品更有利于對血糖的有益調(diào)控。值得注意的是，近年來為了迎合消費者口感的需求，市場上的出現(xiàn)了阻止蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素的苦蕎加工技術(shù)，生產(chǎn)的苦蕎食品中蘆丁含量高且口感不苦，深受消費者喜愛，那么這些富含蘆丁的苦蕎食品，雖然沒有槲皮素效果好，但也仍然具有一定的調(diào)控血糖的作用。

糖苷結(jié)構(gòu)的增加會引起信號通路的變化及信號通路強度的變化。蘆丁和異槲皮素（100及400 μmol/L）不能激活胰島素依賴型信號通路中的IRS-1及AKT磷酸化表達。有研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁不能促進大鼠骨骼肌細胞的InsR及AKT的磷酸化[24]。蘆丁可能是通過胰島素依賴型信號通路的另外一條PKC信號通路促進葡萄糖攝取作用[28]。因此，蘆丁和異槲皮素在低濃度下（100 μmol/L）對于糖攝取的促進作用可能是通過胰島素依賴型的其他信號通路，而非AKT通路。在高濃度下（400 μmol/L），蘆丁和異槲皮素通過非胰島素依賴型信號通路中的AMPK/ACC磷酸化促進骨骼肌的葡萄糖攝取，并且異槲皮素促進AMPK/ACC磷酸化的效果顯著大于蘆丁。研究結(jié)果與先前報道一致，低濃度（100 μmol/L）的蘆丁不能促進AMPK的磷酸化[24]。異槲皮素能夠促進AMPK的磷酸化，與文獻相符[29]。結(jié)合本研究結(jié)果說明，糖苷結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)的增加可能會下調(diào)AMPK/ACC磷酸化表達，從而導(dǎo)致細胞對于葡萄糖攝取率的下降。槲皮素雖然抑制了胰島素依賴型信號通路IRS-1及AKT磷酸化的表達，但是，在此條件下，槲皮素依舊能通過AMPK/ACC磷酸化顯著促進骨骼肌的葡萄糖攝取，并顯著高于蘆丁、異槲皮素及胰島素的促進作用（P＜0.05）。也有研究表明槲皮素不通過胰島素依賴型的信號通路，而是通過AMPK信號通路并引起線粒體中的能量代謝變化[30]。

綜上所述，蘆丁、異槲皮素及槲皮素均促進C2C12小鼠骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取作用，但是糖苷鍵的增加會降低槲皮素糖攝取的效果，作用順序如下：槲皮素＞異槲皮素＞蘆丁。糖苷鍵的增加下調(diào)非胰島素依賴型信號通路的表達，從而降低糖攝取。帶有糖苷鍵結(jié)構(gòu)的蘆丁和異槲皮素對于胰島素依賴型信號通路中的AKT通路無明顯促進作用，無糖苷結(jié)構(gòu)的槲皮素反而抑制胰島素依賴型信號通路。本研究揭示了不同糖苷結(jié)構(gòu)的黃酮在細胞水平上促進葡萄糖攝取的構(gòu)效關(guān)系的區(qū)別，對于充分理解苦蕎黃酮降血糖機理提供了科學(xué)依據(jù)，有助于根據(jù)消費者實際情況選擇合適的苦蕎加工技術(shù)。