花椒渣超臨界CO2萃取物成分及其活性分析

趙慧娟，許騰騰，趙 楠，劉尊英,

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院, 山東青島 266003；2.利和味道(青島)食品產業股份有限公司, 山東青島 266109）

花椒屬于蕓香科花椒屬植物（Zanthoxylum bungeanum），其干燥成熟果皮因具有芳香濃郁、醇麻爽口的特點而被用做香辛料，是人們常用的食品調味料[1]。花椒提取物主要含有揮發油、生物堿、酰胺、香豆素、脂肪酸，還有黃酮類、多酚類等物質[2-4]，具有抗菌、抗炎、鎮痛、鎮靜和抑制血小板凝集作用[5-6]。Pang等[7]研究表明花椒精油可以通過誘導凋亡來抑制黑色素瘤細胞的入侵和增殖，阻斷信號通路。因此，花椒提取物在食品抑菌[8]、生物藥理等方面具有很大的發展前景。

花椒提取物的制備方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑浸提法等，但這些方法存在提取率低、有機溶劑殘留等缺點，而超臨界CO2萃取技術是一種先進的綠色萃取技術，利用超臨界CO2流體的高滲透力和高溶解力萃取分離提取物，提取過程無毒無害、價格低廉易獲取，逐漸實現大規模工業化應用[9-11]。Carlotta等[12]運用超臨界CO2流體萃取技術，從低價值的雜草和農業廢棄物中有效提取了潛在的抗菌化合物和防腐劑成分。

在超臨界CO2萃取花椒油的工業化制備過程中，會產生大量的花椒渣料，多被直接丟棄，造成資源浪費。本研究利用超臨界CO2流體萃取技術，對花椒渣料進行進一步的萃取，通過色譜串聯質譜（LCMS/MS）技術鑒定渣料提取物中的小分子化合物，并研究花椒渣萃取物的抑菌作用與抗氧化作用，以期為花椒渣的高值化利用提高理論依據及基礎性研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貢椒 利和味道（青島）食品產業股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸 色譜純，Merck KGaA； DPPH、ABTS 索萊寶生物科技有限公司；其他試劑 均為化學分析純；供試菌株副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、希瓦氏菌（Shewanella）、酵母菌（Saccharomyces） 為實驗室保存菌株，經過活化后使用；LB瓊脂培養基（胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂15 g，1 L）、LB肉湯培養基（胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g，1 L） 121 ℃滅菌20 min備用。

HA220-50-06超臨界CO2萃取裝置 南通市華安超臨界萃取有限公司；UHPLC超高效液相色譜儀、Q-Exactive HF高分辨質譜 Thermo Fisher Scientific 公司；Zorbax Eclipse C18（1.8 μm×2.1×100 mm）色譜柱 Agilent technologies公司；多功能酶標儀Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 四種花椒萃取物的制備 花椒萃取物的制備：以貢椒為原料，經粗略粉碎后，進行超臨界CO2萃取，萃取條件為壓力25 MPa，溫度40 ℃，時間5 h，萃取完成后分離得到花椒油樹脂。

花椒渣萃取物的制備：以花椒萃取物剩余渣料為原料，以95%乙醇為夾帶劑，經單因素實驗得到較優提取條件為：夾帶劑流量20 mL/min，溫度45 ℃，壓力25 MPa，時間5 h，經減壓分離得到花椒渣萃取物。

精油和麻素分離物的制備：將花椒油樹脂再次超臨界萃取進行二次精制分離，改變萃取溫度和壓力分離得到花椒精油分離物，在萃取釜中回收得到花椒麻素分離物。

上述萃取物及分離物用無水乙醇溶解稀釋至400 mg/mL，4 ℃保存備用。

1.2.2 色譜與質譜條件 色譜條件：C18色譜柱（Zorbax Eclipse C18（1.8 μm×2.1×100 mm））；流動相 A為0.1%甲酸溶液（含10 mmol/L甲酸銨）；B為純乙腈；洗脫梯度（0～2 min，B 5%；2～7 min，B 30%；7～14 min，B 78%；14～20 min，B 95%；20～25 min，B 5%）；柱溫為 30 ℃；流速 0.3 mL/min；進樣量為 2 μL，自動進樣器溫度4 ℃[13]。

質譜條件：正離子模式：加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；吹掃氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.5 kV；毛細管溫度：330 ℃；SLens RF Level：55%。

掃描模式：一級全掃描（Full Scan，m/z 100～1500）與數據依賴性二級質譜掃描（dd-MS2，TopN=10）；分辨率：120000（一級質譜） & 60000（二級質譜）。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）[13]。

定性、定量：使用Compound Discoverer 3.1對質譜峰進行分析矯正處理，根據二級質譜信息利用Thermo mzCloud在線數據庫，Thermo mzValut本地數據庫等，進行物質鑒定。

1.2.3 抑菌效力測定 抑菌效力測定采用濾紙片擴散法，參考文獻[5,14]稍作修改，將直徑6 mm的圓濾紙片滅菌后浸泡在各樣品中12 h，然后貼在涂布有菌液的LB固體培養基上，溶劑浸泡濾紙片作為對照；將平板置于28 ℃培養箱中倒置培養12 h，觀察各菌的生長情況并記錄數據，重復三次。

1.2.4 最小抑菌濃度測定 最小抑菌濃度（MIC）測定采用二倍試管稀釋法，參考文獻[5,15]稍作修改，取9支試管編號1～9，在1～7號試管中樣品終濃度為 50、25、12.5、6.25、3.125、1.5、0.7 mg/mL；在1～8號試管中加入菌液50 μL，9號試管為培養基空白對照；各管終體積2 mL，將各試管于28 ℃振蕩培養箱中培養12 h，觀察細菌生長情況確定最小抑菌濃度MIC，并將無細菌生長的試管取50 μL倒板，觀察有無菌體生長。每個樣品重復三次。

1.2.5 DPPH自由基清除率測定 DPPH自由基清除率測定參考文獻[16-17]的方法進行，測定前用無水乙醇將樣品稀釋成系列梯度：150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5 mg/mL。用無水乙醇溶解二苯代苦味酰基（DPPH），終濃度為0.1 mmol/L，避光儲存備用。取1.5 mL DPPH溶液，與50 μL待測樣品液混勻，在48孔板中室溫避光反應30 min，在517 nm波長處測定吸光值，記為A1；將1.5 mL無水乙醇和50 μL樣品混勻測定值記為A2，1.5 mL DPPH與50 μL無水乙醇混勻測定值記為A0。重復三次實驗。自由基清除率計算公式如下：

1.2.6 ABTS+自由基清除率測定 參考文獻[17-18]等方法進行測定，測定前用無水乙醇將樣品稀釋成系列梯度：150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5 mg/mL。ABTS儲備液配置：用純凈水配制含7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液的儲備液，暗室避光放置12～16 h。ABTS應用液：將儲備液用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光值為0.7±0.02（大約 40～50 倍）。取 1.5 mL ABTS 溶液，與 50 μL待測樣品液混勻，在48孔板中室溫避光反應6 min，在734 nm波長處測定吸光值，記為A1；將1.5 mL無水乙醇和50 μL樣品混勻測定值記為A2，1.5 mL ABTS與50 μL無水乙醇混勻測定值記為A0。重復三次實驗。自由基清除率計算公式同式（1）。

1.3 數據處理

數據處理采用SPSS 22.0軟件（Statistical Product and Service Solutions，SPSS），數據作圖采用Origin軟件。每組實驗重復三次，結果以平均值±標準差表示。處理間差異采用鄧肯氏多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 花椒渣萃取物LC-MS/MS分析

經LC-MS/MS檢測，花椒提取物中共檢出68種化合物，其中花椒渣萃取物共有50種，檢出化合物占萃取物的91.32%，LC-MS/MS離子譜圖如圖1～圖4所示。從表1可以看出，不同的分離提取條件，化合物成分不同，花椒渣萃取物和花椒萃取物以及花椒麻素的成分含量相近，但與花椒精油的差異較大，可能因為花椒精油中多為揮發性成分。花椒提取物的主要成分有生物堿、烯醇、香豆素、多酚，還含有類固醇、酰胺、黃酮等物質，與其他研究[5,10,19]結果一致。在花椒渣萃取物、花椒萃取物、麻素分離物中，石斛堿、胺環戊酯和噴布特羅三種物質相對含量達60%以上，其中石斛堿的含量最高，分別占38.28%、35.79%、37.19%。石斛堿是一種吡咯里西啶衍生物類生物堿，研究表明石斛堿具有較好的藥用功效，在抗炎癥、心血管保護、神經系統和糖脂代謝調控[20]等方面效果顯著[21]。在精油分離物中，石斛堿、姜黃烯和吐納麝香的相對含量較高，占比38.7%。另外有研究表明黃酮類、生物堿、氨基酸、酚酸等物質多是導致花椒苦味特征的化合物[22]。

表1 四種花椒提取物的成分組成Table 1 Components of of the four Zanthoxylum bungeanum extracts

圖1 花椒渣萃取物LC-MS/MS離子圖譜Fig.1 LC-MS/MS ion-chromatogram of Zanthoxylum bungeanum residue extract

圖2 花椒萃取物LC-MS/MS離子圖譜Fig.2 LC-MS/MS ion-chromatogram of Zanthoxylum bungeanum extract

圖3 麻素分離物LC-MS/MS離子圖譜Fig.3 LC-MS/MS ion-chromatogram of zanthoxylin

圖4 精油分離物LC-MS/MS離子圖譜Fig.4 LC-MS/MS ion-chromatogram of Zanthoxylum bungeanum essential oil

續表1

從LC-MS/MS分析結果可以看出花椒渣萃取物中的活性成分及其含量與花椒萃取物相似，某些成分含量甚至更高，因此花椒渣具有較高的利用價值，可以在提供活性成分的同時實現花椒廢棄渣料的高值化利用。

2.2 花椒渣萃取物的抑菌活性

2.2.1 花椒渣萃取物抑菌效力定性分析 從表2可以看出，花椒渣萃取物對8種試驗菌均具有一定的抑制作用，其中對副溶血弧菌和希瓦氏菌的抑制作用較強，對大腸桿菌的抑制作用較弱。花椒渣萃取物表現出的抑菌活性可能與萃取物中的多酚、黃酮類、生物堿等含量密切相關[23]。此外，花椒萃取物、麻素分離物和精油分離物對試驗菌株也表現出一定的抑菌作用，表明花椒提取物具有廣譜的抑菌性，與Yu等研究結果一致[24]。四種組分中，花椒精油表現出了較強的抑菌作用，伍燕等[17]的研究表明，花椒精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有較好的抑制性，其中對大腸桿菌的抑制效果相對較弱。花椒渣萃取物、花椒萃取物和麻素分離物雖然成分相近，但其具體含量存在差異，并且不同的試驗菌對各物質也表現出不同的敏感性，因此表現出不同的抑菌效力。

表2 四種花椒提取物的抑菌效力Table 2 Antibacterial efficacy of four kinds of Zanthoxylum bungeanum extracts

2.2.2 花椒渣萃取物對各供試菌株的最小抑菌濃度最小抑菌濃度結果表明，不同提取物對不同菌種的MIC存在較大差異（表3），花椒渣萃取物對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌和希瓦氏菌的抑制作用最強，其MIC均為3.125 mg/mL，其次為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌，其MIC分別為6.25和12.5 mg/mL，對大腸桿菌的抑制作用最弱，其MIC為25 mg/mL，結果與抑菌效力實驗一致。其他提取物中，精油分離物的抑菌性較強，對副溶血弧菌、希瓦氏菌以及釀酒酵母的MIC為均為0.7 mg/mL，花椒萃取物與麻素分離物抑菌作用較弱。

表3 四種花椒提取物的最小抑菌濃度MICTable 3 MIC of four kinds of Zanthoxylum bungeanum extracts

2.3 花椒渣萃取物的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率 提取物的DPPH自由基清除率如圖5所示，花椒渣萃取物的清除率最高，在50 mg/mL時清除率達到91.35%，而花椒萃取物和麻素分離物只有38.27%和59.42%，清除率呈濃度依賴性，存在顯著性差異（P＜0.05）。精油分離物的清除率最低，在150 mg/mL的濃度下，清除率只有12.4%，可能與提取成分的化合物種類和相對含量有關。由此可見，DPPH自由基清除能力大小：花椒渣萃取物＞麻素分離物＞花椒萃取物＞精油分離物。

圖5 四種花椒提取物的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging rates of four Zanthoxylum bungeanum extracts

2.3.2 ABTS+自由基清除率 提取物的ABTS+自由基清除率如圖6所示，各萃取物的自由基清除能力呈濃度依賴性，其中花椒渣提取物的清除率最高，在12.5 mg/mL時清除率達到100%，麻素分離物在50 mg/mL時達到99.48%，花椒提取物在100 mg/mL時達到99.33%，精油分離物的清除率最低，在150 mg/mL的濃度下，清除率只有46.89%，根據前文成分分析結果可知，抗氧化能力的差異可能與主要成分及其含量相關，各提取物之間存在差異顯著性（P＜0.05）。由此可見，ABTS+自由基清除能力大小：花椒渣萃取物＞麻素分離物＞花椒萃取物＞精油分離物。

圖6 四種花椒提取物的ABTS+自由基清除率Fig.6 ABTS+ free radical scavenging rates of four Zanthoxylum bungeanum extracts

3 結論與討論

本研究聯合超臨界CO2流體及95%乙醇夾帶劑制備了花椒渣萃取物，通過LC-MS/MS成分分析鑒定了花椒渣萃取物中共有50種化合物，主要包括生物堿、烯醇、香豆素、黃酮類、酰胺類等物質，并且主要成分石斛堿的相對含量達到了38.28%，有研究表明石斛堿具有較好的藥用價值[25]。柴麗琴等[19]采用GC-MS對花椒油樹脂進行分析，其結果主要是烯醇類、酯類、萜類、花椒素等化合物，與本研究結果一致，但其主成分物質為花椒素，含量達到10.85%，這與花椒的產地、品種、工藝條件、測定方法等因素有關。花椒渣萃取物的物質成分和相對含量與花椒萃取物、麻素分離物相似，但與精油分離物差異較大，因為膏狀萃取物多是不具有揮發性的成分，而精油分離物多是揮發性成分。花椒渣萃取物具有較強的抑菌作用，對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌和希瓦氏菌的抑制作用最強，其MIC均為3.125 mg/mL，其次為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌，對大腸桿菌的抑制作用最弱。花椒渣萃取物具有一定的抗氧化作用，12.5和50 mg/mL的花椒渣萃取物對ABTS自由基和DPPH自由基的清除率分別為100%和91.35%。研究表明不同的提取方式和萃取溶劑所得到的花椒油樹脂的抑菌活性和抗氧化活性具有較大的差異[26]。

本文研究表明了花椒渣萃取物包含多種活性組分，具有一定的抑菌作用和抗氧化作用，在食品、醫藥、飼料等領域具有廣闊的應用開發空間，能夠實現花椒渣料資源的高值化利用。但是本文僅對花椒渣萃取物的抑菌活性和抗氧化活性做了簡單探究，對其抑菌機理缺乏更加深入的探索。另外，對花椒渣料進行超臨界CO2萃取，成本較高，對其提取和利用方式還需進一步優化。