富含γ-氨基丁酸的黑苦蕎發芽的條件優化及成分分析

黃思苑，羅嘉源，葉俊鋒，任運紅，張雅甄，杜 冰,2, ，黎 攀,

（1.華南農業大學食品學院, 廣東廣州510642；2.云南省杜冰專家工作站, 云南普洱665008）

苦蕎作為一種天然功能食品，兼具“營養、保健、醫療”的作用。黑苦蕎是苦蕎的一種，因含有黃酮、多酚、蘆丁、槲皮素等多種生物活性成分而具備獨特的保健功效[1-2]?，F代藥理研究成果表明，黑苦蕎具有降血壓[3]、降血脂[4]和降血糖[5]的“三降效果”，以及抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗炎[8]等多種功能作用。γ-氨基丁酸（GABA）作為黑苦蕎中常見活性物質，具有鎮靜和減輕興奮[9]、調節血壓和改善大腦功能[10]。此外，GABA可以刺激胰島素的釋放，有效預防II型糖尿病[11]，還能促進酒精代謝和抑制癌細胞增殖[12]。雖然GABA有許多重要的生理功能，但人體內的GABA含量會因為年齡和外界壓力的增加而逐漸減少[13]，因此開發富含GABA的功能性食品意義重大[14]。

發芽是一種廉價而有效的加工技術，可以提高谷類和豆類的營養品質。苦蕎萌發過程可以改善苦蕎籽粒的活力，提高相關酶活力及生物活性成分的含量，尤其可以積累GABA等營養物質[15]。同時，發芽會降低黑苦蕎中的蛋白酶抑制劑的活性，能夠提高苦蕎蛋白質中氨基酸的利用率[16]。據報道，谷物GABA含量與浸泡和發芽的溫度和時間息息相關[17]。目前，關于提高GABA產量的研究主要集中在糙米、大豆、燕麥等糧食作物中[2]，有關黑苦蕎GABA的最佳富集工藝鮮有研究。

因此，本研究采用單因素實驗結合響應面法探索發芽黑苦蕎中GABA富集的最佳工藝條件，進一步提高黑苦蕎的營養價值和保健功能，為發芽富集GABA提供理論依據，并為發芽黑苦蕎精準化營養產品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑苦蕎種子 由咀香園健康食品（中山）有限公司（中國廣東省）提供；表兒茶素、γ-氨基丁酸 標準品，Sigma公司；沒食子酸 國藥集團化學試劑有限公司；蘆丁標準品、槲皮素標準品 上海源葉生物科技有限公司；綠原酸標準品 北京普天同創生物科技有限公司；山奈酚標準品 中國食品藥品檢定研究所；無水乙醚、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑、氫氧化鈉、95%乙醇、三氯化鋁、乙酸鉀、甲醇、鹽酸、次氯酸鈉等 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

UV759紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；FA2004A分析天平 上海精天電子儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州市華普達數學儀器有限公司；DHP-600電熱恒溫培養箱 京市永光明醫療儀器廠；LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色譜柱，美國安捷倫公司；DGG-9070B鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；ANKE TDL-5-A離心機 上海安亭分析儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 黑苦蕎種子浸入5%的NaClO溶液中消毒15 min，然后用蒸餾水洗滌5次，之后在15～40 ℃的蒸餾水中浸泡2～12 h。將種子置于具有2層濾紙的培養皿中，再覆蓋3層濕潤的紗布，放入恒溫培養箱中，在15～40 ℃和80%相對濕度的恒溫培養箱中放置2～7 d，以獲得發芽的黑苦蕎，在發芽過程中，每6 h更換一次紗布以保持苦蕎濕潤。制備好的發芽黑苦蕎種子與未經過發芽處理的黑苦蕎種子都放在-80 ℃的冰箱中冷凍24 h以后，轉移至真空冷凍干燥器中，干燥48 h后，用粉碎機磨碎，60目過篩，即得到發芽前后的黑苦蕎樣品。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 發芽天數對發芽黑苦蕎GABA含量的影響按照1.2.1所述方法處理黑苦蕎。發芽溫度為25 ℃、浸泡時間6 h、浸泡溫度為25 ℃、相對濕度為 85%，發芽時間分別為 1、2、3、4、5、6 d，測定發芽后苦蕎GABA的含量。

1.2.2.2 發芽溫度對發芽黑苦蕎GABA含量的影響按照1.2.1所述方法處理黑苦蕎。發芽時間為4 d、浸泡時間6 h、浸泡溫度為25 ℃、相對濕度為85%，發芽溫度分別為 15、20、25、30、35、40 ℃，測定發芽后苦蕎GABA的含量。

大多學者認為，負面清單模式可以視為私法自治在行政法領域的延伸。[13]雖然我們認可私法自治對個人權利和自由的尊崇，但私法自治仍存有一定的邊界，即不能損害公共利益和公序良俗，不能違反法律的強制性規定和禁止性規定，否則將受到法律的制裁。此外，市場經濟中市場主體逐利的邊際效用與成本是對市場主體行為的內在約束，網約車與負面清單模式在經濟目標、法律效果上同樣存在邊界的吻合。

1.2.2.3 浸泡時間對發芽黑苦蕎GABA含量的影響按照1.2.1所述方法處理黑苦蕎。發芽溫度為25 ℃、發芽時間為4 d、浸泡溫度為25 ℃、相對濕度為 85%，浸泡時間分別為 2、4、6、8、10、12、14 h，測定發芽后苦蕎GABA的含量。

1.2.2.4 浸泡溫度對發芽黑苦蕎GABA含量的影響按照1.2.1所述方法處理黑苦蕎。發芽溫度為25 ℃、發芽時間為4 d、浸泡時間6 h、相對濕度為85%，浸泡溫度分別為 15、20、25、30、35、40 ℃，測定發芽后苦蕎GABA的含量。

1.2.3 響應面優化試驗 在單因素實驗的基礎上，按照Box-Behnken試驗設計方案，以GABA含量為響應值，進行3因素3水平的響應面實驗設計，通過Design Expert 11軟件對實驗數據進行分析，并預測富集GABA的最佳工藝條件。實驗因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平Table 1 Box Behnken experimental factors and levels

1.2.4 GABA含量的測定 GABA含量的測定參照NY/T 2890-2016所述的高效液相色譜法進行測定。檢測波長 436 nm；柱溫 40 ℃；進樣量 10 μL；流動相A為乙腈，流動相B為質量濃度為6.8 g/L的三水合乙酸鈉溶液；流速1.0 mL/min。GABA標準曲線方程為：Y=113.8X+170.28，R2=0.994。

1.2.5 基本成分的測定 水分測定方法按照GB 5009.3-2016食品中水分測定中所述的直接干燥法進行測定；灰分和脂肪測定分別按照國標GB 5009.4-2016和GB 5009.6-2016中所示的方法進行測定；蛋白質測定按照GB 5009.5-2016食品中蛋白質的測定所示的凱氏定氮法進行測定；碳水化合物的含量通過計算得到，具體計算方式為碳水化合物（g/100 g）=100-（蛋白質+脂肪+水分+灰分）。

1.2.6 生物活性成分測定 樣品中的總黃酮含量按照NY/T 1295-2007蕎麥及制品中總黃酮含量的測定進行測定。采用汪建飛[9]所述的福林酚法測定每個樣品的總酚含量，總酚含量用沒食子酸當量表示。蘆丁、槲皮素、山奈酚和表兒茶素的檢測方法如下：蘆丁含量的測定方法參照《保健食品功效成分檢測方法》中所示的蘆丁的高效液相色譜測定法進行測定；槲皮素和山奈素依照《中國藥典》中所示的方法進行測定；表兒茶素的測定根據Jiang等[18]所述的方法進行測定，樣品經70%甲醇提取后，用高效液相色譜測定法進行測定。

1.3 數據處理

所有實驗均為平行測定3次取平均值，采用Design Expert 11軟件進行響應面試驗設計與分析，數據用SPSS 25.0174軟件進行顯著性分析，P＜0.05，表示差異顯著，P＜0.01，表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

圖1 不同發芽時間對黑苦蕎GABA含量的影響Fig.1 Effect of different germination days on GABA content of black tartary buckwheat

2.1.2 發芽溫度對黑苦蕎中GABA含量的影響 由圖2可知，發芽黑苦蕎中GABA含量隨著發芽溫度而呈現先上升后下降的趨勢，在15～25 ℃，苦蕎內GABA含量逐漸增加，直至25 ℃達到最高，為33.30 mg/100 g，在高于 25 ℃后，GABA含量開始下降?？赡茉蚴菧囟绕呋蚱投紩绊懝劝彼崦擊让傅目臻g結構及其與底物的親和力，從而引起谷氨酸脫羧酶活性下降[12]，因此，最佳發芽溫度為25 ℃。

圖2 不同發芽溫度對黑苦蕎GABA含量的影響Fig.2 Effect of different germination temperature on GABA content of black tartary buckwheat

2.1.3 浸泡時間對黑苦蕎中GABA含量的影響 由圖3可知，發芽黑苦蕎中GABA含量隨著浸泡時間的延長呈現先增加后減少再增加的趨勢，在浸泡時間為6 h時GABA含量最高，為33.0 mg/100 g。在2～6 h，苦蕎內GABA含量快速增加，直至6 h達到頂峰，在 6～8 h，GABA 含量大幅度下降，8～12 h后 GABA含量緩慢增加但低于峰值，12 h后GABA含量后緩慢下降，本研究結果與姜秀杰等[19]的實驗結果一致?？赡茉蚴呛诳嗍w浸泡過程中，GABA合成相關酶被激活，而吸水后，胚內干物質從凝膠狀態轉變為溶膠物質，胚乳中的干物質轉化為可溶性物質，黑苦蕎的物質代謝速率加快，有利于谷氨酸脫羧酶生成[20]。而在6～8 h，細胞吸水膨脹破裂，大量可溶性蛋白溶出，酶活性下降，生成GABA底物減少[13]。因此，最佳浸泡時間為6 h。

圖3 不同浸泡時間對黑苦蕎GABA含量的影響Fig.3 Effect of different soaking time on GABA content of black tartary buckwheat

2.1.4 浸泡溫度對黑苦蕎中GABA含量的影響 由圖4可知，黑苦蕎中GABA含量隨著浸泡溫度的升高而呈現先增加后減少的趨勢。在浸泡溫度為25 ℃時，黑苦蕎中的GABA含量最高，為33.40 mg/100 g。說明適當提高浸泡溫度，有利于提高黑苦蕎GABA的含量。當浸泡溫度過高時，GABA的含量反而出現下降趨勢。本實驗結果和梅嬋等[21]的實驗結果一致，出現這種現象的原因可能是溫度會影響谷物的吸漲速度，也會影響與富集GABA有關酶的活性。在一定溫度范圍內，溫度越高，黑苦蕎的吸水速度越快，胚乳中大分子物質在酶的作用下分解為小分子物質的量越多，為GABA的生成提供了充足的物質基礎[13]。當浸泡溫度過高時，吸漲速度多快，當吸水飽和后，會導致細胞結構破壞，從而導致谷氨酸等水溶性物質損失[14]。

圖4 不同浸泡溫度對黑苦蕎GABA含量的影響Fig.4 Effect of different soaking temperature on GABA content of black tartary buckwheat

2.2 響應面試驗結果與分析

單因素實驗的結果表明，發芽溫度對GABA含量的影響較小，為簡化實驗，減少實驗次數，選擇發芽天數、浸泡時間、浸泡溫度3個因素，以GABA含量為指標進行響應面優化分析。

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 在單因素實驗的基礎上，以發芽時間（A）、浸泡時間（B）、浸泡溫度（C）為自變量，以GABA的含量為響應值（Y），實驗方案和結果如表2所示。利用Design-Expert 11軟件對響應面進行設計與分析，并建立回歸模型，得出二元回歸方程為：GABA （mg/100 g）=33.46-1.16A-0.6375B+1.73C+1.10AB-0.3750AC-1.03BC-3.46A2-2.75B2-3.33C2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

由表3 可知，模型F=95.13，P＜0.0001，說明模型達到了0.1%顯著水平，并且R2=0.9919、R2adj=0.9815、R2pred=0.8921、失擬項P=0.0611＞0.05，說明模型預測性良好且失擬程度不顯著，具有統計學意義。另外，各項顯著性因素統計分析表明，其顯著性大小順序為浸泡溫度＞發芽時間＞浸泡時間。

表3 響應面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

2.2.2 響應面交互項分析 對表3數據進行二次多元回歸擬合，得到二次回歸方程的響應曲面見圖5。GABA的含量隨著各因素水平的增加呈現先上升后下降的趨勢。

圖5 各因素交互作用對黑苦蕎 GABA富集量的影響Fig.5 Effects of interaction of various factors on GABA accumulation in black tartary buckwheat

2.2.3 最優條件的確定 根據響應面試驗結果，得出回歸模型對發芽黑苦蕎中GABA富集量的最大預測值為33.829 mg/100 g，對應條件為發芽時間為3.801 d、浸泡溫度26.266 ℃、浸泡時間為5.783 h，考慮到實際操作的可行性，將培養條件改進為：發芽時間4 d、浸泡時間6 h、浸泡溫度25 ℃。對此條件進行驗證實驗，得到GABA含量為33.40 mg/100 g，驗證值與理論值的相對誤差較少，說明利用響應面法優化的條件對發芽黑苦蕎富集GABA是可行的。

2.3 黑苦蕎發芽前后的成分變化

為進一步探究發芽對黑苦蕎成分的影響，測定在最佳發芽工藝條件下的發芽黑苦蕎與未發芽黑苦蕎的營養成分和活性成分的含量。

2.3.1 黑苦蕎發芽前后營養成分變化 對發芽前后進行營養成分測定，結果見表4。發芽后，黑苦蕎的灰分、粗蛋白質、粗脂肪的含量均有下降，而碳水化合物含量增加。王嘉怡等[22]的研究表明，糙米發芽后，灰分含量會顯著下降，本研究與其結果一致，黑苦蕎發芽后灰分含量下降可能是由于黑苦蕎在萌發過程中會激活植酸酶，植酸酶分解植酸鈣鎂等物質后產生肌醇、磷酸鈣鹽和鎂鹽等可溶性的物質，從而在浸泡和發芽的過程中損失。黑苦蕎的粗蛋白質含量在發芽后出現了小幅度的減少，可能是因為黑苦蕎在發芽的過程中激活了蛋白酶，將蛋白質水解成了小分子的氨基酸和肽，從而導致粗蛋白質含量的下降[23]。黑苦蕎發芽后，粗脂肪含量減少，一方面可能是與脂肪水解給種子功能有關[24]，另一方面可能是脂肪在發芽的過程中發生氧化反應，導致黑苦蕎的粗脂肪含量在發芽后有所降低[25]。巢曉玲等[15]的研究表明，在種子萌發過程中，碳水化合物由于要提供能量，含量會下降，與本實驗的結果相反，其原因可能是本研究中碳水化合物的含量（g/100 g）=100-（蛋白質+脂肪+水分+灰分），隨著蛋白質、脂肪、灰分含量的減少，碳水化合物的含量會增加。

表4 黑苦蕎發芽前后營養成分含量（g/100 g，以干基算）Table 4 Nutrient contents of black tartary buckwheat before and after germination (g/100 g, by dry basis)

2.3.2 黑苦蕎發芽前后活性成分的變化 黃酮和多酚作為黑苦蕎中的主要活性成分，由表5可知，發芽能顯著提高黑苦蕎中總酚、總黃酮、槲皮素、山奈素、表兒茶素、綠原酸含量。發芽后，總酚含量從1.43 g/100 g 增至 2.24 g/100 g（P＜0.01），總黃酮含量從 2.12 g/100 g 增至 2.75 g/100 g（P＜0.05），槲皮素含量從 0.06 g/100 g 增至 0.12 g/100 g（P＜0.05），山奈素含量從 3.98 mg/kg增至 7.42 mg/kg（P＜0.01），表兒茶素含量從4.58 mg/kg增至50.60 mg/kg（P＜0.001），綠原酸含量從9.48 mg/kg增至153.00 mg/kg（P＜0.001）。其中表兒茶素和綠原酸的增幅最大，分別是發芽前的11.05、16.14倍?？偡?、總黃酮是黑苦蕎中主要的活性成分，其含量和組成是影響苦蕎種子功能和營養特性的重要因素。黑苦蕎發芽后，總酚和總黃酮含量顯著上升，可能的原因是苦蕎種子發芽后苯丙氨酸解氨酶的活力會增加，合成了新的多酚類化合物[16]，促使發芽后總酚含量、總黃酮含量的提高，本研究結果與鄭晨曦[17]的研究結果一致。黑苦蕎發芽后蘆丁含量下降，而槲皮素、山奈素、表兒茶素、綠原酸等黃酮類化合物含量上升，可能是因為在發芽過程中，黃酮類化合物發生系列生物轉化，激活了體內的蘆丁降解酶和苯丙氨酸解氨酶。一方面蘆丁降解酶的激活導致蘆丁分解合成了其他黃酮類化合物，另一方面苯丙氨酸解氨酶的活力增加導致多種黃酮類化合物的合成，因此蘆丁含量顯著下降，而槲皮素、山奈素等黃酮類化合物的含量顯著上升[26]。黑苦蕎發芽前后的活性成分含量對比，能有效說明發芽作為一種谷物制備的方法，可用于制備富含總酚、總黃酮、槲皮素、山奈素等生物活性成分的功能性食品。

表5 黑苦蕎發芽前后活性成分含量（以干基算）Table 5 Contents of active components in black tartary buckwheat before and after germination (by dry basis)

3 結論

本研究采用單因素實驗和響應面分析，得出了黑苦蕎在發芽過程中影響其GABA含量的3個主要因素是發芽時間、浸泡時間和浸泡溫度。響應面分析結果確定黑苦蕎最優工藝條件為：發芽時間4 d、浸泡時間6 h、浸泡溫度25 ℃。在此條件下發芽的黑苦蕎GABA含量為33.40 mg/100 g。此外，本研究測定了發芽前后的黑苦蕎基本營養成分和活性成分含量，結果表明，黑苦蕎發芽后，灰分和蘆丁含量顯著下降，粗蛋白質和粗脂肪含量小幅度下降，而碳水化合物、總酚、總黃酮、槲皮素、山奈素、表兒茶素、綠原酸的含量明顯上升。其中表兒茶素和綠原酸的增幅最大，分別是發芽前的11.05、16.14倍。本研究優化和確定了富含GABA黑苦蕎的最佳發芽工藝，在此工藝下，不僅可以在較短的時間獲得高水平的GABA產量，也可以顯著提高黑苦蕎中的生物活性成分的含量。本研究結果為進一步大規模生產富含GABA的黑苦蕎新資源食品的開發提供了理論依據。