卵白蛋白-殼聚糖靜電相互作用對蛋白質結構和熱特性的影響

熊文飛，李 亞，王立峰

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心, 江蘇南京 210023）

利用蛋白質-多糖之間的靜電相互作用來提升單一組分的功能特性（如增稠性、乳化性、起泡性等）和應用范圍，是新型食品配料開發和食品體系穩定性調控的一條可靠途徑，得到了學術界和工業界的普遍重視[1-2]。因而，近年來關于利用不同來源蛋白質-多糖之間靜電相互作用強弱實現不同尺度復合凝聚物組裝的基礎研究和應用報道非常多，且大多數報道均側重于蛋白質與多糖之間靜電作用相行為、熱動力參數、復合物功能特性等的探究[3]。然而，蛋白質-多糖復合凝聚物界面性能的強弱不僅依賴于復合物的尺度效應和理化特性，更主要取決于蛋白質在靜電結合過程中的構象轉變程度[4-7]。因此，探明與多糖的靜電結合作用對蛋白質分子構象的影響，對深入揭示復合凝聚物的界面特性機制具有重要作用。

卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）是雞蛋蛋清蛋白中含量最豐富的蛋白組分，約占蛋清蛋白的54%，對蛋清的功能特性（凝膠性、乳化性和起泡性）及其在焙烤、魚糜等制品中的應用起主導作用[8]。然而，單純蛋白質穩定的界面易受溫度、pH和鹽離子強度等環境因素的影響[9]。為此，過去的報道發現采用酶法和非酶法處理OVA均可有效改善其功能特性[10-11]。然而，這些處理存在過程較復雜、應用性不強等突出缺陷。最近，Niu等[12]發現卵白蛋白與阿拉伯膠（gum arabic，GA）之間的靜電結合誘導蛋白質三級構象去折疊，使更多的色氨酸殘基埋藏在結構內部。此外，OVA/GA復合凝聚物的形成導致蛋白質晶體結構更為有序，且提高了α-螺旋和β-轉角的pH穩定性[13]；這些轉變使得OVA/GA復合物穩定的乳液在pH3.8～7.0范圍內均表現出較好的儲藏、耐鹽和耐熱穩定性[14]。另一方面，在系統研究OVA與殼聚糖（Chitosan，CS）之間靜電相互作用基礎之上[15]，研究發現OVA與CS之間的靜電結合會顯著增強油水界面吸附層的粘彈性和乳液宏觀粘彈性，從而有助于乳液展現出突出的穩定性[16]。然而，OVA與CS之間的靜電結合對蛋白質構象的影響尚未揭示，而這對于深入理解OVA/CS復合物穩定乳液的機制以及相關調控策略的提出具有重要作用。

因此，本文的重點在于借助紫外-可見光譜、圓二色譜、內源熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜探究并比較分析OVA與CS之間的靜電排斥和吸引作用對蛋白質構象的影響，且進一步利用差示掃描量熱儀探明靜電結合對OVA熱穩定性的干擾程度，從而為OVA/CS乳化特性的增強提供更深入理解。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卵白蛋白（Ovalbumin，OVA，A5503，純度大于98%） Sigma公司；殼聚糖（Chitosan，CS，脫乙酰度90.5%，平均分子量約350 kDa） 青島云宙生化公司；其他試劑均為分析級 國藥化學試劑集團。

PE20 pH計 梅特勒托利多；UV3900紫外-可見分光光度計 日本日立公司；Jasco 810型圓二色譜儀 日本Jasco公司；F-4600熒光光譜儀 日本日立公司；Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；Micro DSC III Evo微量熱差示掃描量熱儀 法國Setaram公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 卵白蛋白/殼聚糖混合液的制備 將卵白蛋白（OVA）粉末溶解在去離子水中，于25 ℃溫和攪拌2 h，然后在4 ℃放置過夜以確保蛋白質完全水合而獲得儲備液（1%，w/v）。將殼聚糖（CS）粉末溶解于乙酸溶液（1%，w/v）中，在 25 ℃下攪拌過夜，制備CS（1%，w/v）儲備液。按OVA與CS質量比為3:1配制混合物，然后使用0.5 mol/L鹽酸和0.5 mol/L氫氧化鈉將對照OVA溶液和OVA/CS混合溶液的pH分別調節至4.0和5.5。OVA/CS混合物和對照OVA的總生物聚合物含量均固定在0.2%（w/v）[15]。

1.2.2 紫外可見光譜測定 將如1.2.1所述制備的對照OVA和OVA/CS溶液用去離子水稀釋至蛋白質含量為0.2 mg/mL，并調節其pH至4.0和5.5。然后采用紫外-可見分光光度計在200～700 nm范圍內以5 nm的間隔進行掃描，光程1 cm，響應時間0.2 s[13]。

1.2.3 圓二色譜測定 樣品制備如1.2.2所述。使用圓二色譜儀于25 ℃進行蛋白質溶液的CD光譜掃描，掃描范圍190～240 nm。采用光程為0.1 cm石英皿，光譜分辨率0.5 nm，掃描速度100 nm/min，響應時間0.25 s，帶寬1 nm。累積三次掃描取平均值[8]。

1.2.4 內源熒光光譜測定 樣品制備如1.3.2所述。將樣品置于光程為1 cm的石英皿內，使用熒光光譜儀于25 ℃下進行掃描。激發波長為290 nm，發射光譜范圍為300～460 nm。激發和發射狹縫寬度為2.5 nm，掃描速度 1200 nm/min[8]。

1.2.5 傅里葉變換紅外光譜測定 將1.2.1制備的對照OVA和OVA/CS混合溶液通過冷凍干燥獲得粉末態樣品，然后取適量樣品與溴化鉀混合壓片并采用FTIR光譜儀于4000～400 cm-1范圍內進行掃描，分辨率為4 cm-1。此外，取純CS作為對照[8]。

1.2.6 差示掃描量熱測定 采用微量差示掃描量熱儀探究樣品熱特性。取0.800 g如1.2.1所述制備的樣品置于樣品池，并取等量的去離子水置于參比池。樣品在25 ℃恒溫10 min后，以0.5 ℃/min的速率升溫至 100 ℃[17]。

1.3 數據處理

所有測量均做三次平行取平均值，圖表制作均采用Origin軟件8.0版。

2 結果與分析

2.1 紫外-可見分光光譜分析

一般地，蛋白質在280 nm處的特征吸收峰為酪氨酸和色氨酸殘基，因而通過該吸收峰強度和位置的變化可初步判斷蛋白質構象的轉變情況[18]。從圖1A可以發現，殼聚糖的存在導致OVA的吸收峰發生了約5 nm的紅移；此外，比較吸收強度的差異可觀察到在pH4.0的強度弱低于pH5.5。結合OVA為含有9個酪氨酸和3個色氨酸殘基的單體球狀糖蛋白[19]，這些光譜信息意味著芳香族氨基酸所處的微環境發生了改變，指示蛋白質構象的轉變[20]。這些轉變在卵白蛋白-阿拉伯膠的靜電相互作用體系內也被觀察到[12]。

圖1 不同pH條件下OVA和OVA/CS復合物的零階紫外-可見光譜（A）與二階導數光譜（B）Fig.1 Zero-order (A) and second-derivative (B) UV spectra of OVA and OVA/CS solutions at different pH

為進一步區分OVA構象轉變的差異，對零階光譜曲線進行處理得到二階導數光譜（圖1B）。在280～300 nm范圍內，可以明顯觀察到曲線呈現出兩個最低（285和292 nm）和最高（289和296 nm）吸收峰，其中285 nm吸收峰可能由于是酪氨酸和色氨酸殘基的共同作用，296 nm為色氨酸單獨貢獻的結果[12]。此外，比較296 nm峰形和位置可以發現，CS的存在（包括pH4.0和5.5）導致峰形變扁平且輕微紅移（約2 nm），這表明混合物中OVA的微環境的極性發生了轉變，進一步意味著蛋白質的三級結構去折疊使得色氨酸殘基向親水性區域遷移[21]。類似結果在羧甲基纖維素-溶菌酶和卵白蛋白-阿拉伯膠體系也被報道過[12,22]。

2.2 內源熒光光譜分析

由于球狀蛋白所含有的芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基的暴露情況與蛋白質周圍環境的極性變化直接關聯，故通常利用蛋白質內源熒光光譜來表征其高級構象的去折疊[21,23]。因此基于上一部分紫外可見光譜分析結果，進一步采用內源熒光光譜對蛋白質三級構象的轉變進行表征和確認，結果如圖2所示。顯然地，CS的存在導致OVA的發射熒光強度顯著下降，而pH對單純OVA的影響差異較微弱。在pH4.0時，由于此時處于OVA等電點（約為pH4.85）以下，蛋白質主要荷載正電荷，故OVA與陽離子多糖CS之間以靜電排斥力為主；相反，在pH5.5時，OVA與CS分別荷載負電荷和正電荷，兩者可通過靜電引力形成穩定的溶解性復合物[15]。因此，在樣品所包含的溶解性蛋白質濃度相同的情況下，最大熒光強度的顯著下降也一定程度反映了蛋白質表面芳香族氨基酸暴露程度的變化，進而表明蛋白質三級構象的部分去折疊[24]。此外，由于熒光激發波長為290 nm，只有色氨酸殘基熒光被激發[25]。這說明OVA與CS之間的靜電相互作用導致蛋白質表面色氨酸殘基暴露程度下降，OVA三級構象發生了部分去折疊，且靜電引力（pH5.5）對構象的影響更為強烈。這個結果與紫外可見光譜的發現基本一致，Niu等[12]在OVA-阿拉伯膠體系也觀察到類似的現象。

圖2 不同pH條件下OVA和OVA/CS復合物的內源熒光光譜Fig.2 Intrinsic emission fluorescence spectra of OVA and OVA/CS solutions at different pH

2.3 圓二色譜分析

基于上述靜電作用對OVA三級構象的影響，本部分進一步借助圓二色譜對蛋白質的二級結構進行表征，結果如圖3所示。與單純OVA體系（包括pH4.0、5.5）比較，OVA的光譜曲線受靜電作用的影響較明顯。為定量比較不同類型二級結構含量的變化，借助儀器自帶軟件通過楊氏方程對蛋白質二級結構含量進行擬合計算，結果如圖3中表格所示。首先需要指出的是，與天然OVA在中性條件下的不同二級結構含量（α螺旋、β-折疊、β-轉角和自由卷曲的含量分別為49%、13%、14%、24%）比較[26]，pH對其有序二級結構的影響較明顯，這可能是由于蛋白質分子間靜電斥力的減弱（pH4.0和5.5相對于pH7.0更接近等電點）導致分子間發生微弱聚集而產生的構象變化。其次，同單純OVA體系（pH5.5）比較，OVA與CS之間的靜電吸引作用導致其α-螺旋、β-轉角和自由卷曲含量分別下降約26.9%、52.3%、6.0%，β-折疊增加約33.9%。此外，與靜電排斥力（pH4.0）比較，吸引力（pH5.5）導致 OVA-CS 的α-螺旋、β-轉角和自由卷曲含量分別增加約1.5%、7.7%、2.3%，β-折疊下降約2.0%。類似的結果在溶菌酶-羧甲基纖維素體系內也被觀察到[5-6]，這進一步確認了靜電作用誘導蛋白質發生了部分去折疊，且這些變化主要發生在蛋白質的有序二級結構層面。

圖3 不同pH條件下OVA和OVA/CS復合物的圓二色譜Fig.3 Circular dichroism spectra of OVA and OVA/CS solutions at different pH

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析

根據傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）光譜所反映的官能團間的相互作用，可進一步證實蛋白質-多糖之間的靜電相互作用[5-6]。如圖4所示，對于天然OVA在pH5.5，3287 cm-1處的峰對應-OH，1700～1600 cm-1為酰胺I（C=O，自由羧基）的拉伸振動，1575～1475 cm-1為酰胺II的拉伸和彎曲振動，1400～1200 cm-1為由N-H彎曲和CN-拉伸組合形成的酰胺III[27-28]。另一方面，CS的特征峰分別出現在3400、3300、1560和1080 cm-1左右，分別對應于其羥基（-OH）、胺基（-NH2）、酰胺II（N-H彎曲振動與C-N拉伸振動耦合）和糖苷鍵（C-O-C）[29]。此外，盡管 OVA與 CS在pH5.5通過靜電結合形成的復合物也保留了天然OVA所顯示的類似光譜輪廓，但在OVA/CS復合物中與酰胺 I（1650 cm-1，C=O，自由羧基）、-NH3+（1560 cm-1）相關的吸收峰均向低波數移動。這表明OVA的-COO-與 CS的-NH3+之間發生了靜電結合[29]，同時進一步證明了靜電結合對蛋白質構象產生了影響。此外，3600～3000 cm-1處的寬帶表明OVA和CS之間的氫鍵增強，暗示兩者之間還存在氫鍵作用[6]。

圖4 OVA和OVA/CS復合物的傅里葉變換紅外光譜Fig.4 FTIR spectra of OVA and OVA/CS solutions

2.5 差示掃描量熱分析

OVA、CS和OVA/CS靜電結合物（pH5.5）的差示掃描量熱（DSC）數據如圖5所示。首先，純OVA在78 ℃左右呈現出一個典型的吸熱峰，由于實驗過程中為液態樣品且是微量量熱測定程序，因此該溫度為蛋白質的變性溫度。這與文獻報道的液態OVA變性溫度（84 ℃）略有不同[17]，推測可能是pH導致的差異。本實驗樣品體系（pH5.5）相比于中性體系更接近OVA的等電點（pH4.85），蛋白質分子間的斥力減弱而產生微聚集使得結構在加熱過程中更易于展開。此外，由于CS骨架由糖苷鍵串聯形成，其玻璃化轉變溫度高于100 ℃[30]，因此在實驗溫度范圍內未觀察到明顯的吸熱峰。有報道表明，靜電結合作用通常能提高蛋白質的熱變性穩定性[29]，而在OVA/CS靜電復合物體系中也觀察到了這種現象。如圖5所示，OVA的變性吸熱峰從78 ℃上升到83 ℃左右。進一步證實了通過與多糖的靜電結合可有效提升蛋白質的熱變性溫度，這對于一些熱敏性蛋白質（如酶類）是一種簡單、可靠且實用的保護策略。

圖5 OVA和OVA/CS復合物在pH5.5的熱流曲線Fig.5 Heat flow curves of OVA and OVA/CS solutions at pH5.5

3 結論

OVA與CS之間無論是靜電排斥力還是靜電吸引力都會導致OVA的結構發生去折疊，主要表現為色氨酸殘基向親水區域遷移且暴露程度下降；二級結構中α-螺旋、β-轉角和自由卷曲含量分別下降約26.9%、52.3%、6.0%，β-折疊增加約 33.9%。FTIR不僅確認了上述結果，還進一步證明了OVA與CS之間靜電結合作用的存在。此外，OVA的熱變性溫度由于靜電結合作用從78 ℃上升到83 ℃左右，表明其熱穩定性得到了增強。這些發現不僅對深入理解OVA/CS靜電復合物的界面特性提供新的見解，也對相關蛋白質-多糖系統性能調控提供借鑒作用。