咖啡酸對CCl4誘導BRL大鼠肝細胞損傷的保護作用

洪 玥，陳友霞，劉珍珍，林 琳，張天陽，高春燕

（大理大學公共衛生學院, 云南大理 671000）

肝臟是機體最主要的代謝、排泄和解毒器官，具有分泌膽汁、解毒、凝血、免疫等重要生理功能[1?3]。外環境中的藥物、酒精、病毒、化學試劑等極易導致肝損傷的發生，且各種因素導致的肝損傷常伴有氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等[4?7]。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）所致肝損傷的表現及發展與許多人類肝臟疾病類似，常被用于肝損傷的病理研究和保肝藥物的開發[8]。

咖啡酸（caffeic acid，CA）廣泛存在于植物中，是一種安全、無毒害的天然化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌、抗病毒、免疫調節等多種藥理活性，在降低細菌致病力和抗藥性等方面也有很高的應用價值[9?12]。已有研究表明，CA的抗氧化活性主要源于其強大的還原能力和淬滅自由基的能力，它可通過抑制肝細胞氧化應激來改善肝微循環障礙和肝細胞損傷[13?14]。氧化應激與肝損傷的病理進程密切關聯，而Nrf2/ARE是重要的抗氧化應激信號通路，激活該信號通路的傳導對抑制肝損傷的發展具有重要作用[15?16]，但CA在CCl4肝細胞損傷模型中對抗氧化通路激活作用的研究鮮有報道。

采用CCl4誘導BRL大鼠肝細胞損傷模型，以CA進行干預，測定大鼠肝細胞的生化指標、活性氧（ROS）、細胞色素 C（Cyt c）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）水平和部分抗氧化基因的mRNA表達情況，從氧化應激和激活Nrf2/ARE信號通路的角度探討CA對CCl4損傷BRL大鼠肝細胞的保護作用及機制，為肝損傷的靶向治療提供分子基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BRL大鼠肝細胞 購自中國科學院細胞庫；咖啡酸標準品（純度≥99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM高糖培養液、胎牛血清（FBS）美國 Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液（100×）、胰酶細胞消化液、杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS） 上海碧云天生物技術有限公司；四氯化碳 分析純，山東佰仟化工有限公司；活性氧（ROS）試劑盒、細胞色素C（Cyt c）和 8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）酶聯免疫檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol A+總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；iScript? Select cDNA 合成試劑盒、Ssoadvanced?SYBR? Green Supermix 美國 Bio-rad 公司。

MDF-382E(N) 超低溫冰箱 日本SANYO公司；RCO3000T-5-VBC型二氧化碳培養箱 美國REVCO公司；ClassⅡType A2生物安全柜 美國LABCONCO公司；CKX41SF 倒置顯微鏡、BX53倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；SP-Max3500FL多功能熒光酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司；7180全自動生化分析儀 日本Hitachi公司；Micro 21R 臺式高速冷凍離心機 美國 Thermo Fisher 公司；高通量組織研磨儀 美國MP Biomedicals公司；NP80 Touch 超微量核酸蛋白測定儀 德國Implen公司；CFX96 Touch熒光定量PCR儀 美國Bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組 以 DMEM完全培養液（10% 胎牛血清+1% 雙抗）培養BRL大鼠肝細胞，選取對數生長期的細胞進行實驗。實驗組分為對照組、CCl4模型組（100 mmol/L CCl4損傷 3 h）和 CA干預組（含 0.2、0.4和 0.8 mg/mL CA 的 DMEM 溶液預處理 4 h，再行 CCl4暴露 3 h）。

1.2.2 CA對 CCl4所致 BRL大鼠肝細胞損傷 AST、ALT和LDH活力的測定 以5×104/mL的細胞密度接種于 24孔培養板，每孔 500 μL，于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，樣品干預組每孔加入750 μL 濃度為 0.2、0.4 和 0.8 mg/mL 的 CA 溶液，對照組和模型組每孔加入等體積的完全培養液代替樣品溶液。置于CO2培養箱中培養4 h后，模型組和樣品干預組每孔加入CCl4染毒液200 μL，對照組加入等體積的完全培養液，繼續培養3 h。收集各組細胞培養液上清，采用全自動生化分析儀測定AST、ALT和LDH的活力。

1.2.3 CA對 CCl4所致BRL大鼠肝細胞損傷 ROS、Cyt c和8-OHdG水平的測定 以5×104/mL的細胞密度接種于 6孔培養板，每孔 2 mL，于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養24~48 h后，樣品干預組每孔加入 3 mL 濃度為 0.2、0.4 和 0.8 mg/mL 的樣品工作液，對照組和模型組每孔加入等體積的完全培養液代替樣品溶液。于CO2培養箱中培養4 h后，模型組和CA干預組每孔加入CCl4染毒液800 μL，對照組加入等體積的完全培養液，繼續培養3 h。

將ROS各處理組的其中一個培養板于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，另一個細胞培養板參照ROS試劑盒說明書，收集并重懸細胞，稀釋調整細胞濃度，加入DCFH-DA探針、孵育、洗滌、重懸，使用多功能熒光酶標儀測定OD值（激發波長500 nm，發射波長525 nm），結果以對照組為1（對照組OD值/對照組OD值），其他組用相對比值表示（處理組OD值/對照組OD值）。

各處理組細胞培養結束后，棄上清液，收集細胞，通過反復凍融法裂解細胞[17?18]，離心取上清液。按照Cyt c和8-OHdG酶聯免疫檢測劑盒說明書測定OD值，結果以各組OD值與對照組OD值的相對比值表示。運用ELISAcalc軟件，選擇Logistic曲線（四參數）擬合模型，得Cyt c標準曲線四參數擬合方程為 Y=(A?D)/[1 + (X/C)B]+D，A=1.1690，B=1.6028，C=251.7827，D=0.0387，R2=0.9983；8-OHdG 標準曲線四參數擬合方程為Y=(A?D)/[1+(X/C)B]+D，A=1.1579， B=0.6719， C=10.3982， D=?0.3350，R2=0.9998。

1.2.4 損傷抗氧化基因mRNA水平檢測 細胞處理同1.2.3，采用試劑盒提取不同實驗組BRL大鼠肝細胞的總RNA，RNA純度=A260/A280，范圍在1.8~2.1之間說明RNA純度較高，可以進行逆轉錄[19?20]。根據 Bio-radiScript Select cDNA 合成試劑盒說明書進行反轉錄，設計引物及合成（見表1）。使用BioradSsoadvancedTMSYBR Green Supermix 試劑盒進行實時熒光定量 PCR 測定，程序為：95 ℃ 3 min →（95 ℃ 10 s → 60 ℃ 30 s）×40 個循環。以β-actin 作為內參對照，根據各基因的 Ct值，按 2?ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量[21?22]。

表 1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.3 數據處理

運用SPSS 17.0統計軟件和ELISAcalc軟件對實驗數據進行處理，實驗結果用平均值±標準差（x±s）表示，組間均數的兩兩比較采用LSD法檢驗，顯著性檢驗水準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 CA對CCl4損傷BRL大鼠肝細胞培養液上清中AST、ALT和LDH活力的影響

由表2可知，CCl4模型組BRL大鼠肝細胞培養液上清中的AST、ALT和LDH活力較對照組分別升高了 277.18%、99.40% 和 100.82%（P<0.01）。與模型組相比，隨著CA預處理濃度的升高，BRL大鼠肝細胞培養液上清中AST活力下降了19.64%~35.90%，ALT活力下降了15.02%~45.05%，LDH活力下降了14.09%~27.99%。這表明CA能夠有效抑制CCl4所致的AST、ALT和LDH活力的異常升高，保護 CCl4所致肝細胞損傷的發生，且隨著CA濃度的提高，保護作用增強。

表 2 咖啡酸對 CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細胞培養液上清中AST、ALT和LDH活力的影響Table 2 Effect of caffeic acid on the AST, ALT and LDH activities in the supernatant of BRL hepatocyte injured by CC14

2.2 CA對CCl4損傷BRL大鼠肝細胞內ROS水平的影響

如圖1所示，與對照組相比，CCl4處理組大鼠肝細胞中綠色熒光顯著增強，說明細胞中ROS水平明顯升高。與模型組相比，各干預組細胞中二氯熒光黃（dichlorofluorescein，DCF）熒光強度明顯減弱。由圖2可知，CCl4處理組大鼠肝細胞中ROS水平是對照組的132.33倍，差異具有統計學意義（P<0.01）；而經CA預處理后再行CCl4暴露的細胞中ROS水平較模型組均顯著降低（P<0.01），且隨著CA干預濃度的升高分別降低了47.28%、93.84% 和97.75%。

2.3 CA對CCl4損傷BRL大鼠肝細胞細胞質中Cyt c水平的影響

如圖3所示，CCl4模型組的大鼠肝細胞細胞質中Cyt c含量是對照組的3.92倍，差異有統計學意義（P<0.01）；相較于 CCl4模型組，0.2 mg/mL的CA 溶液干預效果不顯著（P>0.05），而 0.4 mg/mL和 0.8 mg/mL CA干預組BRL大鼠肝細胞細胞質中Cyt c含量分別下降了50.52%和57.99%（P<0.01）。

Cyt c可直接參與介導細胞凋亡，也可通過擾亂呼吸鏈中的電子傳遞、促進ROS生成和阻斷能量合成等途徑在細胞凋亡過程中發揮作用[23]。正常狀態下，Cyt c在線粒體的內膜和外膜之間，不會透過外膜進入到胞漿中。當細胞受到不良刺激時，ROS的過量產生可使線粒體通透性增加，同時膜電位的崩潰以及線粒體腫脹、破裂的發生都將促使Cyt c釋放進入細胞質[24]。

2.4 CA對CCl4損傷BRL大鼠肝細胞質中8-OHdG含量的影響

如圖4所示，CCl4模型組的大鼠肝細胞中8-OHdG含量是對照組的9.64倍，差異性顯著（P<0.01），表明在CCl4的損傷作用下，大鼠肝細胞發生了明顯的氧化損傷。相較于 CCl4模型組，0.2、0.4和0.8 mg/mL CA樣品干預組的細胞中8-OHdG含量分別降低了49.79%、72.20% 和83.20%（P<0.01）。

圖 1 咖啡酸對 CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細胞胞內 ROS 水平的影響 （200×）Fig.1 Effect of caffeic acid on intracellular ROS levels of CCl4-injured BRL hepatocyte (200 ×)

圖 2 咖啡酸對 CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細胞胞內ROS水平的影響Fig.2 Effect of caffeic acid on intracellular ROS levels of CCl4-injured BRL hepatocyte

圖 3 咖啡酸對 CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細胞細胞質中Cyt c水平的影響Fig.3 Effect of caffeic acid on the cytoplasm Cyt c level of CCl4-injured BRL hepatocyte

圖 4 咖啡酸對 CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細胞細胞質中8-OHdG含量的影響Fig.4 Effect of caffeic acid on cytoplasm 8-OHdG content of CCl4-injured BRL hepatocyte

8-OHdG與多種氧化損傷疾病具有關聯性，是最常采用的氧化應激敏感指標和DNA損傷標志物[25]。正常條件下機體可對DNA氧化損傷進行修復，然而當損傷超出自身修復能力或修復機制異常時，就會導致8-OHdG堆積，進而引發致畸、致癌、致突變等損傷效應[26]。

2.5 CA對CCl4損傷BRL大鼠肝細胞抗氧化基因mRNA水平的影響

如圖5所示，與對照組細胞相比，CCl4模型組細胞中Nrf2、GSR、NQO1和SOD基因的 mRNA表達水平無顯著變化（P>0.05）。經0.2、0.4和0.8 mg/mL的CA預處理后再行CCl4暴露的各組細胞中Nrf2、GSR、NQO1和SOD的mRNA表達水平較模型組顯著升高（P<0.05）。隨著CA預處理濃度的升高，Nrf2的 mRNA表達水平分別為模型組的 2.61、3.51倍和4.52倍；GSR的mRNA表達水平分別為模型組的1.69、2.41倍和2.98倍；NQO1的mRNA表達水平分別為模型組的3.57、5.58倍和8.01倍；SOD的mRNA表達水平分別為模型組的2.12、2.31倍和4.04倍。且各基因的mRNA表達水平隨CA預處理濃度的增加而逐漸上升。

圖 5 咖啡酸對 CCl4 損傷 BRL 大鼠肝細胞 Nrf2、GSR、NQO1和SOD基因mRNA水平的影響Fig.5 Effect of caffeic acid on mRNA levels of Nrf2, GSR,NQO1 and SOD in CCl4-injured BRL hepatocyte

Nrf2是機體重要的抗氧化調節因子，活化的Nrf2能夠促進抗氧化酶的表達，清除細胞內過量的ROS，調節細胞凋亡[27?28]。大量研究表明，Nrf2/ARE通路是機體抗氧化應激的重要通路，在抗炎、抗凋亡、抗細胞損傷等方面也發揮著重要作用[29]。本研究結果顯示，CCl4損傷的大鼠肝細胞中Nrf2水平并未提高，而經CA預處理后再行CCl4染毒的各組細胞中Nrf2、GSR、NQO1和SOD基因的mRNA表達水平均顯著升高，表明CA對BRL大鼠肝細胞損傷的保護作用與激活Nrf2/ARE信號通路有關。

3 討論與結論

CCl4所致的肝細胞損傷與氧化應激密切相關，而CA可有效抑制CCl4損傷的BRL大鼠肝細胞培養液中AST、ALT和LDH活力的升高，抑制細胞內ROS、Cyt c和8-OHdG水平的異常升高，上調Nrf2、GSR、NQO1和SOD基因表達。其作用機制可能是通過直接增強大鼠肝細胞清除自由基的能力或上調細胞中Nrf2的表達水平，激活Nrf2/ARE抗氧化通路，調節多個抗氧化基因的表達，在轉錄水平上提高細胞的抗氧化防御能力，從而減少氧化損傷。這與SU等[30?33]的研究結果一致，即酚類化合物可通過激活Nrf2/ARE信號通路啟動抗氧化機制，從而提高抗氧化基因或蛋白的表達，發揮抗氧化作用。該研究結果為CA的保肝作用機制提供了一定的理論依據，但抗氧化相關蛋白表達情況以及Nrf2通路的激活機制仍需進一步研究。