驢骨膠原蛋白成分分析及促進皮膚修復活性的研究

樊雨梅，史傳超，帖 航，張筱梒，趙海晴，廖 峰,

（1.國家膠類中藥工程技術研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東聊城 252201；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

皮膚屏障功能是皮膚最重要的功能之一，在保護機體免受環境傷害、防止微生物入侵、調節體溫、避免體內水分流失、維持內環境相對穩定等方面發揮重要的作用。空氣污染[1]、氣候因素、紫外線照射、過度清潔、衰老[2]等會影響皮膚屏障功能[3]。皮膚屏障受損與多種皮膚疾病的病因、病理過程相關，比如濕疹、銀屑病、接觸性皮炎、特異性皮炎等[4?6]。因此，皮膚屏障功能的修復對緩解皮膚炎癥、預防和治療皮膚疾病有著重要的意義。

近年來，研究表明植物油[7]、植物多糖[8]、膠原蛋白/膠原水解物[9]等天然成分能夠有效修復皮膚屏障。其中，膠原蛋白在抗衰老、保濕、防護紫外線損傷、促進成纖維細胞增殖和細胞外基質分泌等方面已有廣泛的應用[10]。研究表明，膠原蛋白對角質形成細胞的增殖、遷移和維持干細胞特性有較好的作用[11]。另外，基于鳥槍法的蛋白質組學數據揭示膠原蛋白肽能夠調節角質形成細胞中的炎性因子表達，并誘導與皮膚屏障維持相關的蛋白表達[12]。豬、牛的皮和骨是提取膠原蛋白的主要來源，但由于存在瘋牛病的風險和宗教原因，海洋來源的膠原蛋白得到了廣泛關注，比如魚類[13]、魷魚[14]、水母[15]等。然而，海洋來源的膠原蛋白因亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量較低導致變性溫度低而限制其廣泛應用[16]。相比于豬羊，目前有關驢的疫病國內外并無相關文獻報道[17]，可見驢骨作為提取膠原蛋白的原料相對安全。因此，本文在采用超高效液相色譜綜合高分辨率軌道分析質譜（UPLC-Orbitrap MS）技術定性分析驢骨膠原蛋白有效成分的基礎上，通過體外實驗評價驢骨膠原蛋白對角質形成細胞增殖、遷移的影響，旨在為其應用于表皮屏障修復提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢骨 山東天龍驢產業研究院；乙腈、甲醇、甲酸 均為質譜純，百靈威科技有限公司；2-氯苯丙氨酸 GL Biochem（Shanghai）Ltd；SLS（Sodium Lauryl Sulfate，十二烷基硫酸鈉，ω≥98.5%）、地塞米松（ω≥97%） Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶/EDTA、PBS、青霉素/鏈霉素、DMEM培養基 Gibco公司；BrdU試劑盒 Roche公司；CCK-8試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；永生化人角質形成細胞（HaCaT） 協和細胞庫3111C0001CCC000373。

LC-MS（ Ultimate 3000LC， Orbitrap Elite） 、MULTISKAN GO多功能酶標儀、371二氧化碳培養箱 Thermos公司；DHP-9272B恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；Axio Observer.D1倒置熒光顯微鏡 ZEISS公司；ACQUITY UPLC HSS T3柱 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 驢骨膠原蛋白的制備 經實驗室多次制備，最終確認驢骨膠原蛋白的制備工藝為：驢骨解凍清洗破粒后，驢骨與水的質量體積比為1:2，升溫至140 ℃，攪拌3 h，虹吸出液，加入1倍純凈水，60 ℃加酶（風味蛋白酶，酶活：1.52×104U/g）酶解 1 h 后，升溫至140 ℃滅酶1 h，獲得驢骨膠原蛋白液，蛋白液均質、濃縮、噴霧干燥后得驢骨膠原蛋白粉。

1.2.2 驢骨膠原蛋白營養成分的分析 蛋白質含量依據GB 5009.5-2016 中凱氏定氮法進行蛋白測定[18]，氨基酸的測定采用GB /T 5009.124-2016 的方法測定[19]。

1.2.3 驢骨膠原蛋白全成分分析

1.2.3.1 樣品前處理 稱取約50 mg驢骨膠原蛋白，加入 800 μL 甲醇溶液，并加入 10 μL 內標（3.0 g/L，2-氯苯丙氨酸）。將其置于組織研磨儀中65 Hz研磨120 s。水浴超聲30 min后置于4 ℃離心機中，12000 r/min離心 15 min，吸取 200 μL上清，轉入進樣小瓶中待LC-MS檢測分析。

1.2.3.2 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫為 40 ℃，流速恒定0.3 mL/min。流動相組成：A相：水+0.1%甲酸；B相：乙腈+0.1%甲酸。進樣量4 μL，自動進樣器溫度4 ℃，流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫程序Table 1 Elution procedure of mobile phase

1.2.3.3 質譜條件 正離子模式：加熱器溫度300 ℃，鞘氣流速 45 arb，輔助氣流速 15 arb，尾氣流速1 arb，電噴霧電壓3.0 kV，毛細管溫度350 ℃，S-Lens RF Level 30%。負離子模式：加熱器溫度300 ℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速為15 arb，尾氣流速1 arb，電噴霧電壓3.2 KV，毛細管溫度350 ℃，S-Lens RF Level 60%。

掃描模式：一級全掃描（Full Scan, m/z 50~1000）與數據依賴性二級質譜掃描（dd-MS2, TopN=10）；分辨率：一級質譜為60000、二級質譜為17500。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）。

1.2.4 細胞水平探究驢骨膠原蛋白皮膚修復活性

1.2.4.1 驢骨膠原蛋白對HaCaT細胞生存活力的影響 將處于對數生長期的HaCaT細胞以密度1×105個/mL接種于 96孔板，每孔 100 μL，常規培養24 h后，換上含有驢骨膠原蛋白的DMEM完全培養基，每孔100 μL。另設空白對照組（不含細胞）、對照組加入相同體積的DMEM完全培養基，每組設3個平行復孔。在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養48 h后，用200 μL預溫的PBS清洗2次。去除清洗溶液，每孔準確加入100 μL CCK8工作液，于37 ℃、5% CO2培養箱培養1~3 h，在450 nm下測定吸光度。按照下式計算細胞存活率。

1.2.4.2 驢骨膠原蛋白對HaCaT細胞增殖的影響收集對數生長期HaCaT細胞，按照細胞密度為1×104個/孔接種至 96 孔板，每孔含培養液 100 μL。在培養箱（37 ℃，5% CO2）中培養 24 h后，加入含有受試物的培養基，以1% FBS作為陽性對照，以未處理細胞作為空白對照。加藥后在培養箱（37 ℃，5%CO2）中繼續培養48 h，然后進行BrdU試驗，以不做BrdU處理作為背景對照，每個濃度設置1個背景對照，以BrdU處理不含細胞的微孔作為溶劑對照背景，于450/690 nm下讀取吸光度OD值。按照下面公式計算細胞增殖率。

1.2.4.3 驢骨膠原蛋白對HaCaT細胞遷移的影響收集對數生長期HaCaT細胞，按照細胞密度為8×105個/孔接種至6孔板，每孔含培養液2 mL。在培養箱（37 ℃，5% CO2）中培養 24 h后，使用無菌槍頭劃出劃痕，用PBS沖洗2次以去除劃痕區殘留細胞。劃痕后隨機分為陽性對照組、空白對照組和實驗組，每組設置3個平行。加入2 mL含有不同濃度的驢骨膠原蛋白且不含血清的培養基（陽性對照除外）后，在培養箱（37 ℃，5% CO2）中繼續培養 24 h后，于倒置顯微鏡下觀察劃痕區細胞的愈合情況并照相記錄，使用Image-Pro Plus 6.0計算劃痕區面積的平均值，按照下面公式計算劃痕區遷移率。

1.3 數據處理

應用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析，實驗重復3次，數據結果以“均數士標準差”（）表示。多組數據差異比較采用方差分析，兩組間差異比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。*表示與空白對照組相比，P<0.05；**表示與空白對照組相比，P<0.01。

2 結果與分析

2.1 驢骨膠原蛋白基礎成分分析

采用國標法測定驢骨膠原蛋白的蛋白含量為57.5%，氨基酸的組成見表2。驢骨膠原蛋白中，甘氨酸的含量最多，占總氨基酸的24.04%；其次是脯氨酸、谷氨酸和丙氨酸；不含有半胱氨酸，且組氨酸、酪氨酸和蛋氨酸含量比較低。根據KITTIPHATTANABAWON等[20]和王曉軍等[21]的報道，I型膠原蛋白中甘氨酸、脯氨酸含量豐富，且甘氨酸約占氨基酸總量的1/3，半胱氨酸、組氨酸、蘇氨酸和色氨酸的含量很低甚至沒有。因此，推斷驢骨膠原蛋白為I型膠原蛋白。驢骨膠原蛋白氨基酸組成與耗牛骨[21]、鹿骨[22]相似，均為典型的膠原蛋白氨基酸組成。

表2 驢骨膠原蛋白的氨基酸組成及含量Table 2 The amino acid composition and content of donkey bone collagen

2.2 驢骨膠原蛋白全成分分析

應用多質量分析器組合式質譜儀對驢骨膠原蛋白進行MSn級掃描，最終獲得驢骨膠原蛋白主要營養成分信息，形成樣本的營養成分譜庫。圖1為驢骨膠原蛋白的總離子流圖。根據Compound Discoverer軟件處理得到Mass數據，基于Metlin數據庫進行全譜鑒定。共鑒定出87種營養成分，詳細信息見表3。

表3 驢骨膠原蛋白LC-MS全譜鑒定Table 3 Compound identification of donkey bone collagen by LC-MS

圖1 驢骨膠原蛋白總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatogram of donkey bone collagen

2.2.1 氨基酸及其衍生物 由上述實驗結果知，驢骨膠原蛋白共鑒定出16種氨基酸及其衍生物，其中有5種必需氨基酸（賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸和亮氨酸），含有牦牛骨膠原蛋白[23]、雞骨明膠[24]、鹿骨膠原蛋白[22]、羅非魚骨膠原蛋白[25]不含有的色氨酸，后面需進一步的實驗進行驗證。值得注意的是，驢骨膠原蛋白含有γ-氨基丁酸、牛磺酸、焦谷氨酸、亮氨酸、精氨酸等活性氨基酸。γ-氨基丁酸是一種神經抑質，可通過激活GSK-3β/Nrf-2通路保護胰腺組織、減少胰島β細胞損傷和影響mTOR/S6K1/IRS-1途徑提高肌肉對胰島素的敏感性，進而緩解2型糖尿病患者的胰腺損傷和胰島素抵抗狀態[26]。研究發現，補充適量牛磺酸能夠降低糖尿病動物血糖水平，改善糖尿病癥狀[27]。這些物質可以從分子角度解釋驢骨治療糖尿病的物質基礎。焦谷氨酸是皮膚的天然保濕因子，對酪氨酸氧化酶等酶類的活性有一定抑制作用，阻止“類黑素”物質在皮膚中積沉，使皮膚亮白[28]。精氨酸可通過促進成纖維細胞增殖、膠原合成，有效促進創面的愈合[29]。亮氨酸具有加快皮膚細胞的新陳代謝、促進皮膚組織再生和愈合等效果[30]。這些物質在一定程度上揭示了驢骨膠原蛋白具有促進傷口愈合的功效。

續表3

2.2.2 有機酸類 目前國內外學者對骨膠原蛋白中有機酸成分的研究較少。本文利用LC/MS技術從驢骨膠原蛋白中鑒定出11種有機酸，如乳酸、水楊酸等。小分子有機酸是化妝品的重要成分之一，可滲透至皮膚角質層，使老化角質層中的細胞鍵合力減弱，加快細胞更新速度，促進死亡細胞脫離，從而使皮膚表面光滑、細嫩、柔軟[31?32]。

2.2.3 脂質類 從驢骨膠原蛋白中共鑒定出46種脂質類，低于李蘭杰等[33]報道的驢骨粉脂肪酸種類（52種），且未鑒定出羊脂酸等脂肪酸，可能與所使用的檢測方法不同有關，后面需進一步進行驗證。α-亞麻酸、亞油酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、前列腺素、白細胞三烯等多不飽和酸及其代謝產物被稱為“美容酸”，有防止皮膚老化、延緩衰老、促進毛發生長等功效。驢骨膠原蛋白含有的杜鵑花酸對表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、皮屑芽孢菌等細菌有很好的抗菌效果[34]，也對治療色素沉著和痤瘡有很好的效果[35]。

2.2.4 糖類 現代研究已經證實糖類成分具有保濕、延緩衰老、血管美容、抗粉刺、曬后修復和美白等眾多護膚功效[36]。由表3可知，鑒定出驢骨膠原蛋白有6種糖類，包括葡萄糖酸、海藻糖等對皮膚有益的糖類。

2.2.5 其他成分 利用多重質譜在驢骨膠原蛋白中還鑒定出尿囊素、肌肽、維生素B5等活性成分。尿囊素具有促進細胞生長、加快傷口愈合、軟化角質蛋白等生理功能，是皮膚創傷的愈合劑和抗潰瘍藥劑，對糖尿病、痤瘡均有較好的療效[37]。肌肽可通過抗氧化、抑制端粒縮短和線粒體損傷、抗糖基化等作用抑制衰老[38]。維生素原B5不僅能夠起到防止頭發分叉、刺激毛發生長、提高光澤度等作用，也可起到保濕、促進修復以及抗炎等作用[30]。綜上，驢骨膠原蛋白在治療糖尿病、促進傷口愈合、護膚等方面具有一定的物質基礎和研究價值。

2.3 驢骨膠原蛋白皮膚修復活性的初步探究

2.3.1 驢骨膠原蛋白對HaCaT細胞活力的影響 不同濃度驢骨膠原蛋白作用HaCaT細胞48 h后，與空白對照組相比，0.125~1 g/mL的驢骨膠原蛋白能顯著促進HaCaT細胞的生長（P<0.05），在驢骨膠原蛋白濃度為0~0.063 g/mL時，HaCaT細胞的增長并無明顯變化，結果見圖2。結果表明，在適宜濃度下驢骨膠原蛋白能夠促進HaCaT細胞的增長。

圖2 驢骨膠原蛋白對HaCaT細胞存活率的影響Fig.2 Effects of donkey bone collagen on the survival rate of HaCaT cells

2.3.2 驢骨膠原蛋白對HaCaT細胞增殖的影響CCK8法主要是通過檢測活細胞內線粒體的能量代謝活性來反應活細胞的數目和細胞活力，則CCK8的檢測結果并不能完全確定驢骨膠原蛋白一定能促進HaCaT細胞增殖。而BrdU是胸腺嘧啶的類似物，可代替胸腺嘧啶選擇性整合到復制期細胞新合成的DNA中，并隨著DNA復制進入子細胞，再通過BrdU特異性抗體檢測BrdU的摻入來判斷細胞的增殖活力[8]，因此，采用BrdU法可更準確地檢測驢骨膠原蛋白對細胞增殖的影響。結果發現驢骨膠原蛋白在0.01~0.15 g/mL范圍內能夠以劑量依賴方式促進HaCaT細胞的增殖，且與空白對照組相比均具有顯著性差異（P<0.05）（見圖3a）。由圖3b可知，0.15 g/mL的驢骨膠原蛋白促增殖效果最明顯，其增殖率達到（125.71%±9.25%），極顯著高于空白對照組的細胞生長率（100.00%±2.55%，P<0.01），與陽性對照組5%的胎牛血清的細胞生長率相近（130.26±5.45%，P>0.05），增殖作用明顯。

圖3 驢骨膠原蛋白（a）和各處理組（b）對HaCaT細胞增殖的影響Fig.3 Effects of donkey bone collagen（a）and different treatments（b）on the proliferation of HaCaT cells

2.3.3 驢骨膠原蛋白對HaCaT細胞遷移的影響 采用細胞體外劃痕實驗，探討不同濃度驢骨膠原蛋白對HaCaT細胞遷移能力的影響。利用Image pro plus軟件計算、比較0 h和24 h劃痕面積的變化，結果顯示（見圖4，圖a放大倍數50倍），與空白對照組相比，5%胎牛血清作用后，HaCaT細胞遷移率增加28.99 %，差異顯著（P<0.01）。與張澤曦[39]報道的胎牛血清對HaCaT細胞遷移率影響的效果一致，表明實驗體系構建成功。與空白對照組相比，0.038、0.075和0.150 g/mL的驢骨膠原蛋白均能極顯著增加HaCaT細胞遷移率（P<0.01），其中0.150 g/mL的驢骨膠原蛋白效果與5%胎牛血清促進HaCaT細胞遷移的效果無顯著差異性（P>0.05）。可見，驢骨膠原蛋白能夠顯著促進HaCaT細胞的遷移融合，具有良好的皮膚屏障修護效果。

圖4 驢骨膠原蛋白和各處理組對HaCaT細胞遷移的影響Fig.4 Effects of donkey bone collagen and different treatments on the migration of HaCaT cells

3 結論

利用HPLC串聯多重質譜的手段鑒定出驢骨膠原蛋白中的87種營養成分，包括氨基酸及其衍生物類、糖類、有機酸類、脂質類等。驢骨膠原蛋白含有杜鵑花酸、肌肽、尿囊素、精氨酸、亮氨酸、有機酸等多種對皮膚有益的成分。角質形成細胞增殖和遷移的能力對維護皮膚屏障功能有著重要的意義。結果表明，1 g/mL以內的驢骨膠原蛋白對HaCaT細胞無毒性，濃度范圍在0.01~0.15 g/mL的驢骨膠原蛋白以劑量依賴方式促進HaCaT細胞的增殖。且0.15 g/mL的驢骨膠原蛋白促HaCaT細胞增殖和遷移的效果與5%胎牛血清類似，顯著優于空白對照組（P<0.05）。初步證明驢骨膠原蛋白對皮膚屏障功能受損具有一定的修復作用，推測可能與驢骨膠原促進HaCaT細胞增殖和遷移有關。本研究對驢骨膠原蛋白進行了較為系統的活性成分研究與皮膚屏障修復體外功效評價，為驢骨深層次開發利用提供了理論依據。