熵權法結合Box-Behnken響應面法優化北柴胡醋炙工藝及其對小鼠肝損傷保護作用研究

董 蕊，逯 影，王 盼

（吉林農業大學中藥材學院, 吉林長春 130118）

對乙酰氨基酚（Acetaminophen, APAP）是一種被廣泛使用的解熱鎮痛藥物。近年來，在我國對乙酰氨基酚過量使用導致的急性肝損傷呈上升趨勢[1?2]。研究已發現天然植物中的苷類、黃酮、多酚、生物堿等成分對急性肝損傷有保護作用[3?4]。

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根，又稱北柴胡。柴胡性微寒，味苦、辛，歸肝膽經，具有保肝、抗炎等作用[5]。柴胡在我國應用廣泛，不僅用于藥用，還可以用于保健，如含有柴胡的藥膳（香蘇柴荊蒸豬肝）、柴胡保健酒等。中醫認為，柴胡有升舉陽氣、疏肝解郁的功效。在藥性五味中，醋以酸味為主，酸味入肝，因此柴胡入肝以醋柴胡為主。研究表明，柴胡醋炙后增強了藥效入肝的作用[6?7]，其抗抑郁的效果強于醋炙前[8]，因此增加了醋柴胡在臨床上的應用[9?10]。柴胡醋炙后其皂苷含量發生變化，在醇提液中柴胡皂苷A（Saikosaponin A,SSA）增加，柴胡皂苷 D（Saikosaponin D, SSD）減少。有研究表明SSA對脂多糖與D-半乳糖誘導的肝損傷有保護作用[11]，SSD對人肝細胞具有保護作用[12]。而且柴胡成分復雜，醇溶性浸出物中包含了多種有效成分，常被用作質量標準的指標，且柴胡醋炙后浸出物含量會略有增加[13?14]。

目前，大多數省市的炮制規范收錄了醋炙柴胡，但其炮制工藝的描述中，對醋炙柴胡醋用量、悶潤、炒制等多用適量、文火等專業術語，對具體的炮制工藝參數并不明確，炮制過程中缺乏可量化的工藝參數，導致各省市炮制工藝參數均有差異，不利于飲片規范性生產[15?16]。并且有些省市對醋柴胡皂苷含量的質量標準沒有要求，只對其浸出物含量做出了標準，極大的影響了醋制柴胡的質量[17]。以前對于柴胡的工藝優化多數采用正交試驗法[18?20]。正交試驗主要側重試驗次數與如何科學的安排實驗，并且只能分析離散型數據，精度不高，預測性不佳。而響應面法采用非線性模型，能求得高精度的回歸方程，進行合理預測來找出最優工藝條件[21]。

熵權法是一種客觀賦權法，相對于主觀賦權法，精確度高，客觀性強[22]。它通過樣本數據計算直接得出權重，不受人為主觀因素的影響，已經廣泛應用于各類藥材、植物品質評價中[23?24]。因此，本研究將SSA、SSD、浸出物等作為醋炙工藝的評價指標，采用熵權法計算各指標的綜合評分，結合Box-Behnken設計法確信試驗因素對試驗指標在非線性影響條件下各因素與指標之間的影響[25]，優化北柴胡醋炙工藝。建立小鼠APAP誘導下急性肝損傷模型，研究柴胡醋炙后對藥物性肝損傷的作用變化，為醋柴胡在治療急性肝損傷的應用上提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性ICR小鼠 SPF級，體重20~22 g，來源于吉林農業大學實驗動物中心，許可證：SYXK(吉)2018-0023，實驗動物在室內溫度（22±2）℃，相對濕度（55%±5%），的無菌培養室中飼養，保持正常晝夜交替，給予充分的進食和飲水，適應性飼養一周后開始進行實驗；柴胡 黑龍江齊齊哈爾肇源縣，經吉林省鼎盛藥材檢驗公司鑒定為北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根；柴胡皂苷A對照品 純度93.2%，批號：110777-201510、柴胡皂苷D對照品純度95.8%，批號：110778-201711 中國食品藥品檢定研究院；對乙酰氨基酚（Paracetamol, APAP） 阿拉丁試劑有限公司；N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine, NAC） 翌圣生物科技有限公司；天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒

南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒 北京誠林生物技術有限公司；其他試劑 分析純。

HC-2517高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；SPECTRO star Nano全波長掃描式酶標儀 德國BMG LABTECH公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀 美國熱電公司；CY式滾筒炒藥機 康華制藥機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生柴胡飲片制備 取北柴胡原藥材，除去殘莖及雜質、洗凈、潤透、切厚片、干燥、即得[26]。

1.2.2 醋炙柴胡炮制工藝 北柴胡飲片，置于槽內，加入一定量的米醋，悶潤至米醋吸浸，放入炒藥機內炒制一定時間，取出、放涼。

1.2.3 SSA、SSD含量的測定

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：Amethyst C18-H（4.6 mm×250 mm，5 μm，120 ?)；流動相：乙腈 (B)-水 (A)；洗脫梯度：0~50 min，75%~10% A；50~60 min，10% A；流速：1.0 mL/min；波長：210 nm；柱溫為室溫，進樣量：5 μL。

1.2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取柴胡皂苷A對照品 7.52 mg、柴胡皂苷D對照品 9.34 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，備用。

1.2.3.3 供試品溶液的制備 將醋柴胡飲片粉碎后，過藥典四號篩。精密稱定0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，用封口膜封好瓶塞，密塞，30 ℃水溫超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，用甲醇 20 mL分2次洗滌容器及樣品，洗液與濾液合并置蒸發皿中，水浴鍋加熱，回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（孔徑0.45 μm）濾過，取續濾液置液相小瓶，在“1.2.3.1”色譜條件下檢測SSA、SSD含量。

1.2.4 浸出物含量測定 取醋柴胡粉末（過四號篩），精密稱取 2 g，置于 250 mL錐形瓶中，精密加95%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，保持微沸1 h。放冷后，密塞，再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，至干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量[27]，計算其浸出物含量。

1.2.5 多指標綜合評分法建立 熵權法是確定指標權重的客觀賦權法，可用來確定多指標評價系統中各指標權重[28]。設有m個待評價對象，n個評價指標，原始矩陣為 X= (Xij) m×n，i=1,2,···, m；j=1, 2, ···, n。對原始矩陣進行標準歸一化處理，得到矩陣Y=(Yij) m×n。本實驗中m=15，n=3，采用極值法對原始數值進行標準化處理，使矩陣Y中的任一數值處于[0, 1]之間[29]。

式中：Yij為第i個評價對象的第j個評價指標的標準化值；Xij為第i個評價對象的第j個評價指標的原始數值；max Xij和min Xij分別表示第i個評價對象在第j個評價指標上的最大值和最小值。

對統計數據進行標準化后即可計算各指標的信息熵。

式中：Hj為第j個評價指標的熵值；Pij為第i個評價對象在j指標下的概率。

式中：Wj為第j個評價指標的熵權。

SSA、SSD、浸出物的權重分別為0.3318、0.3392、0.3290。綜合評分 M=SSA含量×0.3318＋SSD含量×0.3392＋浸出物含量×0.3290。

1.2.6 單因素實驗

1.2.6.1 醋用量對綜合評分的影響 稱北柴胡生飲片5份，每份1 kg，分別加入15%、20%、25%、30%、40%的米醋，悶潤3 h，于130 ℃炒藥機炒制15 min。研究醋用量對綜合評分的影響。

1.2.6.3 炒制溫度對綜合評分的影響 稱北柴胡生飲片5份，每份1 kg，加入25%的米醋，悶潤3 h，分別于 110、120、130、140、150 ℃ 炒藥機炒制 15 min。研究炒制溫度對綜合評分的影響。

1.2.7 響應面試驗

1.2.7.1 響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上，以醋用量、悶潤時間、炒制溫度為考察因素，綜合評分M為響應值，運用 Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken響應面法設計3因素3水平的試驗條件。Box-Behnken響應面法因素水平編碼見表1。

表1 響應面試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface testing

1.2.8 柴胡、醋柴胡保肝作用初探

1.2.8.1 藥物配制 稱取柴胡粉末（過四號篩）20 g，10倍量70%乙醇，浸泡40 min后，采用加熱回流的方式提取兩次，每次1.5 h，合并兩次濾液，水浴蒸干得干浸膏，配制成含柴胡生藥3 g·mL?1的水溶液。稱取醋柴胡粉末（過四號篩）20 g，以同樣的方法制取醋柴胡水溶液，含生藥 3 g·mL?1，備用。

1.2.8.2 APAP誘導小鼠肝損傷模型建立 取ICR小鼠40只，正常食水適應性飼養7 d后隨機分為5 組，每組 8 只。（1）空白對照組（C）；（2）模型對照組（M）；（3）陽性對照組（NAC）；（4）柴胡組（S）；（5）醋柴胡組（VS）。S組每天灌胃柴胡水溶液3 g·kg?1；VS 組每天灌胃醋柴胡水溶液 3 g·kg?1；C組、M組灌胃同體積的生理鹽水；NAC組灌胃150 mg·kg?1N-乙酰半胱氨酸水溶液；連續灌胃 7 d，末次給藥1 h后給予M組、NAC組、S組、VS組小鼠一次性 APAP 腹腔注射（250 mg·kg?1）。C 組給予腹腔注射同體積的生理鹽水，24 h后，進行眼球采血和解剖，造模和解剖前分別保證小鼠禁食不禁水12 h 以上[30]。

1.2.8.3 柴胡、醋柴胡對小鼠血清中ALT、AST水平的影響 根據試劑盒說明書檢測血清指標丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。

葡萄酒就像女人。女人可以帶給男人刺激、放松和撫慰。每一個成熟的女人都藏著無數個少女死去的生命。逝去的少女為葡萄酒般的女人而存在。葡萄酒般的女人為男人而存在。幾乎所有的一切：相貌、穿著、情緒、情感……甚至，每一個器官。女人沒有自我。世界充斥著各種各樣的謊言，男女平等就是最滑稽、最動聽、最虛偽并且最惡毒的謊言。

1.2.8.4 柴胡、醋柴胡對小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響 嚴格按照ELISA試劑盒中的說明書檢測并計算小鼠血清中白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1，β型（Interleukin-1β）的炎癥因子水平。

1.2.8.5 柴胡、醋柴胡對小鼠肝組織中GSH、GSHPx和SOD活性及MDA含量的影響 嚴格按照試劑盒說明書測定肝臟組織中的丙二醛（MDA）含量、還原型谷胱甘肽（GSH）水平、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活力等。

1.2.8.6 H&E染色 取肝臟組織右葉石蠟包埋切片，進行蘇木-伊紅染色，觀察其病理情況。

1.3 數據處理

采用SPSS 23.0數據分析軟件對變化顯著性分析。使用Excel 2010軟件對數據進行統計分析并繪制圖表，使用Design Expert 10進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 SSA、SSD含量測定

2.1.1 標準曲線的繪制 SSA、SSD 的色譜圖如圖1。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標作線性回歸方程，得標準曲線，SSA：y=8170532x?82372（r=0.9997）。線性范圍：0.376~7.52 μg；SSD：y=10338950x?170696（r=0.9968）。線性范圍：0.467~9.34 μg。

圖1 混合對照品（A）、醋柴胡樣品（B）和柴胡樣品（C）的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference（A）, vinegar Chai Hu sample（B）and Chai Hu sample（C）

2.2 單因素實驗

2.2.1 醋用量對綜合評分的影響 當醋量低于20%時，其綜合評分較低，可能柴胡飲片無法吸收到陳醋，內部成分不能轉化完全；當醋用量為25%時，綜合評分最高；超過30%時，在規定時間內，還有剩余陳醋未吸盡；因此選擇25%作為響應面試驗的中心點，結果見圖2A。

2.2.2 悶潤時間對綜合評分的影響 悶潤時間2 h時，醋被吸盡，但評分較低；悶潤時間為3 h時，醋已吸盡，綜合評分最高；在4 h和5 h時，評分未有顯著變化（P>0.05），故選擇3 h為響應面試驗的中心點，結果見圖2B。

圖2 醋用量、悶潤時間、炒制溫度對綜合評分的影響Fig.2 Effect of vinegar dosage, smothering and wetting time and frying temperature on the overall score

2.2.3 炒制溫度對綜合評分的影響 120 ℃時，部分水分超過2020版《中國藥典》規定的10%，因此舍棄120 ℃；130 ℃時，水分測定合格，符合藥典規定，但綜合評分較低；140 ℃時，水分合格，飲片顏色淡棕黃色，片型較好，有醋香氣，符合藥典規定，且綜合評分最高；150 ℃時，飲片顏色接近深黃棕色，有焦香氣，綜合評分降低。因此選擇140 ℃為中心點，結果見圖2C。

2.3 響應面結果與分析

2.3.1 響應面模型與方差分析 實驗設計與結果見表2。對表2進行回歸分析，得擬合方程：M=5.43?0.026A?0.09892B+0.016C+0.048AB+0.011AC?0.01024BC?0.048A2?0.57B2?0.011C2。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken trial design and results

對模型進行方差分析結果見表3。由表3可知，模型極顯著P<0.01，失擬項不顯著P>0.05。說明模型擬合度好，試驗與實際情況較貼合。模型中的A、C極顯著P<0.01，單項B顯著P<0.05；交互項 AB極顯著P<0.01；A2、B2極顯著P<0.01。由F值可知三個因素對綜合評分的影響為醋用量>炒制溫度>悶潤時間。

表3 回歸模型方差結果Table 3 Regression model variance results

2.3.2 響應面曲面分析 各因素交互作用對綜合評分的影響見圖3。響應面坡度越大表明該因素對響應值影響越大，從圖3可知各因素對綜合評分影響排序為醋用量>炒制溫度>悶潤時間。從圖3A等高線可知悶潤時間與醋用量的交互作用對綜合評分影響較大；從圖3B中可知，炒制溫度與醋用量的交互作用較弱；從圖3C可知，悶潤時間與炒制溫度交互作用對綜合評分影響較弱。應用軟件預測最佳炮制工藝為：醋用量22.93%，悶潤時間2.79 h，炒制溫度145.0 ℃，綜合評分為7.285。

圖3 醋用量、悶潤時間、炒制溫度兩兩交互作用的響應面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction between vinegar dosage, smothering and wetting time and frying temperature

2.4 工藝驗證

為便于實際生產，將工藝參數調整為醋用量23%，悶潤時間2.8 h，炒制溫度145 ℃。使用此條件平行3次，各指標含量的平均值分別為SSA 0.65%，SSD 0.74%，浸出物20.67%，綜合評分為7.128（RSD<1%），與預測值的7.285偏差為2.155%。說明工藝穩定性好，可重復性高。

2.5 柴胡、醋柴胡保肝作用初探

2.5.1 柴胡、醋柴胡對APAP誘導急性肝損傷小鼠ALT、AST的影響 結果如圖4。ALT和AST是檢測肝損傷的兩種標示性轉氨酶[31]。肝細胞受到損傷時，大量的ALT、AST酶類物質釋放到血液中，不同的ALT、AST水平可以表示肝損傷程度[32]。與C組相比，M組的ALT、AST水平顯著上升（P<0.05），由此可知，APAP誘導的肝損傷模型建立成功；VS組、S組、NAC組相較于M組，血清中的ALT、AST都顯著下調（P<0.05）；其中VS組與S組相比，VS組的各指標下調更為明顯。

圖4 柴胡、醋柴胡對APAP誘導急性肝損傷小鼠AST、ALT的影響(n=8)Fig.4 Effect of Chai Hu and vinegar Chai Hu on AST and ALT in APAP-induced acute liver injury mice (n=8)

2.5.2 柴胡、醋柴胡對小鼠血清中炎癥因子水平的影響 結果如圖5。IL-6、IL-1β、TNF-α是重要的細胞炎癥因子，當其水平大幅度上升代表機體出現嚴重的炎癥反應[33]。TNF-α是肝臟中的重要的促炎因子；IL-6是參與機體免疫應答的炎癥因子；IL-1β也可預示著炎癥的發生，因此三種炎癥因子的水平可以表達APAP誘導的急性肝損傷的受損程度[34]。APAP導致IL-6、IL-1β、TNF-α在M組小鼠血清中具有最高表達量（P<0.05）。VS組、S組與M組相比，IL-6、IL-1β、TNF-α表達量顯著降低（P<0.05），但略高于NAC組。因此可以看出，柴胡、醋柴胡可以抑制血清中的炎性因子 TNF-α、IL-6、IL-1β的表達，并且醋柴胡的作用更為顯著（P<0.05）。由此可知，醋柴胡、柴胡可以通過調控APAP引起的炎癥反應，改善肝損傷。

圖5 各組小鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 炎癥因子水平（n=8）Fig.5 IL-1β, IL-6 and TNF-α serum cytokine levels of mice in different groups (n=8)

2.5.3 柴胡、醋柴胡對小鼠肝組織中GSH、GSHPx和SOD活性及MDA含量的影響 結果如圖6。在APAP誘導的小鼠急性肝損傷中，氧化應激也是發生機制之一，大量的氧自由基量生成和氧化應激次數的增多會加重肝損傷過程[35]。MDA是脂質過氧化的最終產物之一，它的水平多少可以直接表達脂質過氧化程度。SOD含量的高低反映了機體抗氧化能力；GSH在APAP誘導小鼠肝損傷的過程中對NAQPI有著解毒的作用，而GSH-Px則可以較好的反映抗氧化能力[36]。與C組相比，M組的MDA顯著高于 C 組（P<0.05），SOD、GSH、GSH-Px顯著低于C組（P<0.05）。與M組比較，NAC組和VS組各項指標均具有顯著性差異（P<0.05）。S組對GSH和GSH-Px改善不明顯。

圖6 柴胡、醋柴胡對小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、GSH、MDA的影響(n=8)Fig.6 Effect of Chai Hu and vinegar Chai Hu on SOD, GSH-Px, GSH and MDA in mouse liver tissues (n=8)

2.5.4 H&E染色結果 小鼠肝組織病理圖像如圖7。C組具有完整的肝小葉結構，肝細胞排列緊密。M組結構發生了改變，細胞腫脹，有炎癥因子浸潤和細胞出血的情況。NAC組肝細胞形態基本恢復正常，組織結構較完整。S組肝臟的肝小葉出現部分損傷，有一定面積肝壞死。VS組肝臟有小面積損傷，肝細胞邊緣較清晰，極大程度地緩解了APAP導致的肝損傷。

圖7 APAP誘導肝損傷小鼠的肝組織病理圖像（400×）Fig.7 Histological images of the liver tissue of mice with APAP induced liver injury（400×）

3 結論

柴胡在醋制過程中經過加熱、與米醋中成分反應后活性發生變化，并且米醋的醋用量對柴胡肝保護有一定作用 。SSA、SSD均有一定的保肝作用，有學者從柴胡醋制生物學效應方面發現，柴胡醋制后與生柴胡有顯著差異[36]。

本實驗采用熵權法結合Box-Behnken響應面設計的方式，優化醋炙柴胡的炮制工藝，得到醋炙柴胡優化的炮制工藝：醋用量23%，悶潤時間2.8 h，炒制溫度145 ℃，其指標含量分別為SSA 0.65%，SSD 0.74%，浸出物20.67%，綜合評分為7.128。并且通過工藝驗證得出此工藝穩定、可靠，可以為細化醋柴胡飲片標準提供一些參考。

研究結果表明，醋柴胡對APAP誘導的小鼠急性肝損傷有改善作用。醋柴胡可有效降低肝損傷小鼠血清中的AST、ALT活力水平，下調血清中的IL-6、IL-1β、TNF-α炎癥因子水平，使肝組織中的SOD、GSH、GSH-Px活性顯著上升（P<0.05），MDA含量顯著下降（P<0.05）。而柴胡飲片對于GSH和GSHPx水平作用不顯著（P>0.05）。由以上可知，醋柴胡對APAP誘導的小鼠急性肝損傷有治療作用，可能與SSA含量或浸出物中的其他組分增加有關，其機制可能是通過降酶保肝、抗氧化應激、抑制炎癥因子的釋放等途徑抑制急性肝損傷。柴胡醋炙后的其他組分對急性肝損傷的作用有待進一步研究。

綜上所述，本研究對比了柴胡醋炙前后對APAP誘導的小鼠急性肝損傷治療作用，為柴胡、醋柴胡治療APAP誘導的急性肝損傷補充了理論依據，進一步擴大柴胡、醋柴胡的應用。