荔枝多酚微膠囊的制備工藝優化及其特性分析

張漢輝，程杏安, ，李俊杰，黃 相，東方云，劉 欣，劉展眉，蔣旭紅,

（1.仲愷農業工程學院化學化工學院, 廣東廣州 510225；2.廣州南洋理工職業學院教學科研部, 廣東廣州 510900）

荔枝(Litchi chinensisSonn.)為無患子科，主產于我國廣東、廣西、海南等地[1]。荔枝中含有大量的酚類物質，如黃酮、酚酸、單寧等多類活性成分[2]，具有抗氧化[3]、抗炎[4]、降血糖[5]及抑癌[6]等多種重要的生物活性。目前有關荔枝多酚的研究大多停留在提取純化方面，謝三都等[7]通過超聲波提取荔枝殼多酚，提取率為37.10%；董麗紅等[8]通過C18硅膠層析柱將荔枝果肉多酚提取物分離出4個成分群。但荔枝多酚易氧化，對溫度、光照、pH等較為敏感[9]，并且荔枝多酚在體內容易與生物大分子發生相互作用，從而導致其生物利用度降低[10]，因此，提高荔枝多酚的穩定性具有重要的意義。

微膠囊技術是一種或多種組分通過天然高分子材料對某種基質進行包埋，從而實現對包埋物有效遞送的技術[11]。利用微膠囊技術對荔枝多酚進行包埋，可保護其活性物質免受環境影響，提高其氧化穩定性，并具有緩釋效果。常用的微膠囊制備方法包括噴霧干燥法、化學交聯法及復凝聚法等[12]，噴霧干燥法雖然設備要求低，但處理不當易造成結塊、粘壁及噴頭堵塞等問題[13]；化學交聯法主要運用合成高分子材料進行包埋，這類材料一般化學穩定性高，但生物相容性差[14]；而復凝聚法操作簡單，反應條件相對溫和，無有毒試劑，可批量生產[15]，因此在各領域的應用中具有明顯的優勢。OIHANE等[16]通過復凝聚法制備白藜蘆醇微膠囊，包埋率達41.72%，具有較好的耐酸性；石靜文等[17]通過復凝聚法制備了蘋果多酚微膠囊，包埋率高達85.13%，在腸道中具有良好的釋放性能。目前，仍缺少對荔枝多酚進行包埋的相關研究。

本實驗以海藻酸鈉、殼聚糖為壁材，采用復凝聚法制備荔枝多酚微膠囊，以包埋率為評價指標，通過正交試驗優化制備工藝，并對其體外釋放性能、抗氧化活性及溫度穩定性進行測定。以期為荔枝多酚的高值化利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荔枝多酚（純度≥70%） 西安瑞盈生物科技有限公司；海藻酸鈉 高純級，合肥博美生物科技有限責任公司；殼聚糖（中粘度，200~400 mpa·s）、磷酸氫二鈉（分析純）、檸檬酸（分析純）、2,2’-聯氮雙 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS+，98%) 上海麥克林生化科技有限公司；碳酸鈉、氯化鈣、無水乙醇、鹽酸、沒食子酸 分析級，天津市大茂化學試劑廠；福林酚試劑 生物試劑純，南京都萊生物技術有限公司。

SU8010型掃描電子顯微鏡 日本日立電子儀器有限公司；UV-2450型紫外分光光度計 美國安捷倫科技有限公司；BSA124S型電子分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；BSH012383型真空干燥器 江蘇華鷗玻璃有限公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器 中國榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 荔枝多酚微膠囊的制備 取一定量的海藻酸鈉，加入到磷酸緩沖液（41.1 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉與158.9 mL 0.1 mol/L檸檬酸混合配制pH3.0的磷酸緩沖液），并于60 ℃下加熱溶解，待溶解完全后冷卻至室溫，加入一定量的荔枝多酚；采用滴注法把氯化鈣溶液逐滴注入至混合液中，液滴迅速包裹形成膠珠，反應一段時間（即包埋時間）后將膠珠浸泡在氯化鈣溶液中，于4 ℃下靜置過夜，使其硬化。過濾除去氯化鈣溶液，用去離子水清洗數遍，將凝膠珠過濾到殼聚糖溶液中復膜，常溫反應15 min，過濾，清洗，于真空干燥器中干燥備用，得荔枝多酚微膠囊。

1.2.2 標準曲線的繪制 精確稱取（0.100±0.001） g沒食子酸，5 mL 70%甲醇溶解，用超純水定容至100 mL配制沒食子酸標準溶液（1 mg/mL）。分別移取 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL的沒食子酸標準溶液于100 mL容量瓶中，分別用超純水定容至刻度，搖勻，質量濃度分別為 20~45 μg/mL，間隔 5 μg/mL。分別移取不同質量濃度的沒食子酸溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加入5 mL 10%福林酚試劑，搖勻。反應3~8 min，加入4 mL 7.5% 碳酸鈉溶液，加水定容至刻度，搖勻，室溫下放置60 min。用 10 mm比色皿、在765 nm波長條件下用分光光度計測定吸光度。以沒食子酸質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 微膠囊工藝的單因素及正交試驗設計 初步固定殼聚糖質量分數1%，氯化鈣質量分數2%，包埋時間1 h，荔枝多酚質量分數1%，海藻酸鈉質量分數2%合成荔枝多酚微膠囊。以微膠囊包埋率為指標優化微膠囊的制備工藝，分別對海藻酸鈉質量分數（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、氯化鈣質量分數（2%、3%、4%、5%、6%）、殼聚糖質量分數（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%）、包埋時間（1、2、3、4、5 h）、荔枝多酚質量分數（0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.5%）進行單因素實驗。

在單因素實驗的基礎上，選取海藻酸鈉質量分數、荔枝多酚質量分數、殼聚糖質量分數三個因素進行L9(34)正交試驗的設計，以微膠囊包埋率為指標確定最佳制備工藝。正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Coded levels of independent variables used for orthogonal array design

1.2.4 微膠囊包埋率的測定 精確稱取荔枝多酚微膠囊（1.0±0.2）g，破碎振蕩，超聲溶解 20 min，靜置，取上清液，測定吸光度，對照標準曲線（下圖1），求得荔枝多酚的含量。荔枝多酚微膠囊的包埋率（Encapsulation efficiency，EE）按下式（1）計算。

圖1 沒食子酸的標準曲線Fig.1 Standard curves of gallic acid

式中：m1為未包埋多酚的質量，g；m0為微膠囊中多酚的質量，g。

1.2.5 掃描電鏡（SEM）分析 取適量微膠囊樣品分散于導電膠上，并進行噴金處理，用SU8010型電子顯微鏡進行觀察。

1.2.6 抗氧化活性的測定 參考鄧姣等[18]、高瑾等[19]的方法，將 5 mL 7 mmol/L 的 ABTS+溶液和 88 μL 140 mmol/L 的 K2S2O8均勻混合，避光放置 14~16 h，得到ABTS+溶液。使用前用無水乙醇稀釋至A734為（0.70±0.02）。準確吸取 ABTS+工作液 2 mL與25 μL不同質量濃度的待測樣品溶液混合搖勻，室溫下避光反應6 min，于734 nm下測其吸光度A1，同時用無水乙醇代替樣品液作為對照測定吸光度為A0，用蒸餾水代替ABTS+作為本底樣液，測得吸光度為A2。用維生素C重復上述步驟。上述所有實驗均重復操作三次，取平均值。

式中：A1為樣品的吸光度；A2為本底樣液的吸光度；A0為空白的吸光度。

1.2.7 微膠囊的體外釋放性能

1.2.7.1 pH對微膠囊溶脹性能的影響 往20 mL的緩沖液（pH2.00、6.86、11.00）中分別加入 0.30 g微膠囊，維持溫度為（37±0.5）℃，60 r/min，分別在 10、20、30、60、120、180 min 時取出稱重，按式（3）計算溶脹率。

式中：m1為t時刻微膠囊的質量，g；m0為微膠囊的初始質量，g。

1.2.7.2 pH對微膠囊體外釋放性能的影響 參照陳文彬[20]、YANG等[21]的方法，往 20 mL的緩沖液（pH2.00、6.86、11.00）中加入微膠囊，維持溫度為（37±0.5）℃，60 r/min，分別在 10、20、30、60、120、180 min時取上清液，同時補充同體積的緩沖液，按式（2）、式（4）計算 ABTS+清除率及多酚釋放率。

式中：m1為荔枝多酚的釋放量，g；m0為微膠囊中荔枝多酚的總量，g。

1.2.7.3 微膠囊的緩釋機理 常見的微膠囊釋放動力學模型如表2所示，將荔枝多酚微膠囊緩釋數據代入方程擬合，以方程的相關擬合系數為評價指標，探究其釋放機理[22]。

表2 數學擬合模型Table 2 Model fitting equations

1.2.8 微膠囊的貯藏穩定性 準確稱取0.30 g荔枝多酚及微膠囊，置于20 mL水中，參照SHAO[23]等的方法，分別于30、40、50 ℃條件下避光放置，10、20、30、60、120、180 min后取樣，進行荔枝多酚含量及ABTS+清除能力的測定，同時補充同體積相應的緩沖液，其中荔枝多酚的保留率按式（5）計算。

式中：m1為t時刻荔枝多酚的含量，g；m0為荔枝多酚的初始含量，g。

1.3 數據處理

實驗均設置3次重復，且所得數值采用平均值±標準差表示，數據統計主要用SPSS 21.0進行統計分析，圖表利用Origin 2019b進行繪制。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

根據沒食子酸質量濃度C（μg/mL）與紫外分光吸光度Abs之間的對應關系，建立線性方程，繪制相對的校準曲線：Y=0.0114x+0.0146（R2=0.9993）。

2.2 荔枝多酚微膠囊的單因素實驗

2.2.1 海藻酸鈉質量分數對荔枝多酚微膠囊包埋率的影響 由圖2可知，隨著海藻酸鈉質量分數的提高，微膠囊的包埋率逐漸升高，并于3.0%質量分數時，包埋率達到最高91.76%。這是由于海藻酸鈉分子中含有G分子鏈，可以跟二價金屬鈣離子鍵合，形成海藻酸鈣三維網狀凝膠結構，稱為蛋盒（egg-box）結構[24?25]，隨著海藻酸鈉質量分數的提高，存在更多的G分子鏈與鈣離子鍵合，形成更穩定的微膠囊，從而提升微膠囊的包埋率。但隨著海藻酸鈉質量分數繼續提高，其分子鏈與鈣離子的鍵合已達到飽和，出現分子鏈過剩的現象，難以形成緊密的網狀結構，造成膠囊包埋率的下降。因此，海藻酸鈉的最佳質量分數是3.0%。

圖2 海藻酸鈉質量分數對微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effects of mass fraction of alginate sodium on the embedding rate of microcapsles

2.2.2 氯化鈣質量分數對荔枝多酚微膠囊包埋率的影響 由圖3可知，隨著氯化鈣質量分數的提高，微膠囊的包埋率逐漸升高，并于3%質量分數時，包埋率達到最高91.44%。這是由于氯化鈣質量分數提高，更多的鈣離子與海藻酸鈉的G分子鏈鍵合，形成更為緊密的網狀結構，從而提升膠囊的包埋率。但隨著氯化鈣質量分數的增大，出現氯化鈣過剩的現象，G分子鏈與鈣離子形成過于緊密的結構，多酚的包埋量有限，造成膠囊包埋率下降。因此，氯化鈣的最佳質量分數是3%。

圖3 氯化鈣質量分數對微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effects of mass fraction of calcium chloride on the embedding rate of microcapsles

2.2.3 殼聚糖質量分數對荔枝多酚微膠囊包埋率的影響 由圖4可知，隨著殼聚糖質量分數的提高，微膠囊的包埋率逐漸升高。這是由于殼聚糖溶解于稀醋酸中，其分子鏈上產生大量帶正電荷的伯氨基，海藻酸鈉在水中可形成大量帶負電荷的羧基，加入殼聚糖溶液時，殼聚糖可通過正、負電荷的靜電作用聚集在海藻酸鈉表面[26?27]，形成第二層膠囊壁。隨著殼聚糖質量分數的提高，殼聚糖將快速包裹于海藻酸鈉膠囊表面，防止制備過程中多酚的損失，從而提高膠囊的包埋率。但隨著殼聚糖質量分數繼續提高，質量分數大于2.0%時，殼聚糖溶液過于粘稠，微膠囊難以均勻復膜。因此，殼聚糖的最佳質量分數是1.5%。

圖4 殼聚糖質量分數對微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effects of mass fraction of chitosan on the embedding rate of microcapsles

2.2.4 包埋時間對荔枝多酚微膠囊包埋率的影響由圖5可知，隨著海藻酸鈉-氯化鈣包埋時間的增加，微膠囊的包埋率逐漸升高，并于3 h時，包埋率達到最高90.26%。當包埋時間大于3 h時，內部多酚逸出，導致包埋率下降。1 h與3 h的包埋率僅相差1.57%，因此從效益最大化考慮，包埋的最佳時間是1 h。

圖5 包埋時間對微膠囊包埋率的影響Fig.5 Effects of embedding time on the embedding rate of microcapsles

2.2.5 荔枝多酚質量分數對荔枝多酚微膠囊包埋率的影響 由圖6可知，隨著荔枝多酚質量分數的提高，微膠囊的包埋率逐漸升高，并于0.8%時，包埋率達到最高89.23%。當荔枝多酚質量分數繼續提高，多酚樣品出現過剩，從而導致膠囊包埋率下降。因此，荔枝多酚的最佳質量分數是0.8%。

圖6 荔枝多酚質量分數對微膠囊包埋率的影響Fig.6 Effects of mass fraction of Lichi polyphenols on the embedding rate of microcapsles

2.3 荔枝多酚微膠囊的正交試驗

在單因素實驗結果的基礎上，確定正交因素的水平范圍為海藻酸鈉質量分數2.5%~3.5%、荔枝多酚質量分數0.6%~1.5%、殼聚糖質量分數1.0%~2.0%，以包埋率為指標，確定荔枝多酚微膠囊的最佳制備條件。正交試驗設計及結果見下表3。

表3 微膠囊制備正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal array design and experimental results

從正交試驗結果表可知：以微膠囊包埋率為評價指標，影響從大到小排序分別是荔枝多酚質量分數>海藻酸鈉質量分數>殼聚糖質量分數。荔枝多酚微膠囊制備的最佳組合為：3.5%海藻酸鈉，0.8%荔枝多酚，2.0%殼聚糖，依照上述條件進行方法驗證，得到的包埋率是（95.74%±0.89%）。

2.4 荔枝多酚微膠囊掃描電鏡分析

如圖7所示，制備的荔枝多酚微膠囊外貌近似球狀，直徑為1~1.5 mm。制得的微膠囊粒徑均一，外表不平滑；從圖7c觀察，微膠囊內部結構緊密，可對荔枝多酚起到緩慢釋放的效果。

圖7 微膠囊全貌（a）、微膠囊（b）、膠囊內部結構（c）的電鏡圖Fig.7 SEM of lichi polyphenols microcapsules

2.5 體外釋放性能

2.5.1 pH對微膠囊溶脹性能的影響 由圖8可知，膠囊處于pH6.86（模擬腸液）時溶脹率最大，這是由于羧基發生電離,氨基發生質子化，分子之間的靜電斥力加大,降低了微膠囊的交聯密度，隨后引起微膠囊溶脹[28]。當膠囊處于pH11.00時，微膠囊表面的殼聚糖在堿性環境下會沉淀固化，氨基質子化趨勢減弱，結構收縮[29]，從而導致微膠囊溶脹率較pH6.86低。當膠囊處于pH2.00（模擬胃液）時溶脹率最低，這是由于氨基和羧基都呈現出不同程度的質子化，—NH2的質子化作用(—NH3+)使得靜電斥力和親水性增加,但—COO－的質子化作用使—COOH、—NH2和—OH之間形成氫鍵而導致高分子鏈收縮,導致其溶脹率較低[30]，說明膠囊在胃液中相對穩定，可較好地保護荔枝多酚；而膠囊在模擬腸液中溶脹率最大，表明荔枝多酚能較好地在腸道逸出，達到精準釋放的效果。

圖8 膠囊在pH2.00、6.86、11.00的溶脹性能Fig.8 Swelling properties of microcapsules at pH2.00、6.86、11.00

2.5.2 pH對微膠囊體外釋放性能的影響 由圖9可知，隨著pH的升高，膠囊溶液的多酚釋放率及ABTS+清除率呈現先升高后降低的現象，表現出明顯的pH敏感性。膠囊在pH2.00（模擬胃液）時，膠囊的釋放率及ABTS+清除率隨時間的增長并無較大變化，30 min時多酚釋放率達到7.05%，ABTS+清除率為7.48%，3 h后多酚釋放率為7.59%，ABTS+清除率為8.89%，兩者并無明顯變化，并逐漸趨于平穩，表明膠囊的壁材可較好地保護荔枝多酚，并未在酸性環境中嚴重破壞，可在酸性環境中停留較長時間。而pH6.86（模擬腸液）時，膠囊的釋放率隨時間的增長出現大幅上升的趨勢，30 min時多酚釋放率便達到16.95%，ABTS+清除率達18.22%，3 h后多酚釋放率為 19.66%，ABTS+清除率為 20.30%。當 pH11.00時，膠囊的釋放率較pH6.86時有所下降，多酚釋放率于 30 min后為 13.39%，ABTS+清除率為 7.95%，3 h后多酚釋放率為18.33%，ABTS+清除率為15.56%，表明在強堿環境中膠囊的多酚釋放受到一定的限制，并且釋放的多酚在強堿環境中較不穩定，抗氧化活性明顯下降。且結合圖8分析，膠囊在模擬胃液中的溶脹率最小，在模擬腸液的溶脹率最大，綜合表明膠囊在人體胃液中具有較好的穩定性，可較好地保護多酚，而在腸液中可靶向釋放多酚，使其在腸液中得到吸收利用，并發揮生理作用，具有很好的腸道靶向釋放性。

圖9 膠囊在 pH2.00、6.86、11.00 的多酚釋放率（a）、ABTS+清除率（b）Fig.9 Release curve(a) and ABTS+ scavenging activity(b) of polyphenols microcapsules at pH2.00、6.86、11.00

2.5.3 膠囊在不同pH中的釋放機理研究 為了研究荔枝多酚微膠囊在不同pH下的釋放機理，分別采用零級動力學、一級動力學及Higuchi模型對不同pH下的釋放曲線進行擬合，結果見表4、圖10。由表4、圖10可知，微膠囊在 pH2.00、6.86、11.00的釋放曲線與一級動力學模型擬合度最高，R2分別為0.985、0.995、0.925。可用傳質模型理論來描述芯材釋放的過程[31]，水透過聚合物膜擴散進入微膠囊內，使多酚溶解，由于pH改變了囊壁的物理膨脹性能，結合圖8分析，膠囊在pH6.86時溶脹率最大，因此多酚釋放率達到最大，符合溶脹及緩釋結果。

表4 膠囊在pH2.00、6.86、11.00中的釋放動力學模型Table 4 Release kinetics model of microcapsules at pH2.00、6.86、11.00

圖10 膠囊在pH2.00、6.86、11.00的一級動力學擬合曲線Fig.10 Fitting curves of first-order kinetic model of microcapsules at pH2.00、6.86、11.00

2.6 微膠囊的貯藏穩定性

由圖11可知，隨著溫度的升高，微膠囊、未包埋的荔枝多酚溶液中多酚的保留率呈現持續下降的趨勢。當未包埋的荔枝多酚溶液置于30、40、50 ℃下，3 h后多酚保留率分別下降為80.47%、73.74%、67.19%，說明荔枝多酚對溫度較為敏感，并且溫度越高，溶液中多酚降解越快，這是因為高溫促使多酚生化反應的進行，部分活性物質含有紅色的黃烊鹽陽離子，升溫使其向無色的假堿或查爾酮方向轉化，并且高溫破壞了反應的可逆性，導致活性物質進一步降解，多酚保留率迅速下降[32]。當微膠囊置于30、40、50 ℃下，3 h后多酚保留率分別為82.56%、77.08%、70.08%，多酚保留率均比未包埋的荔枝多酚高，表明荔枝多酚微膠囊化后可有效提高多酚的溫度穩定性。

圖11 荔枝多酚及其微膠囊在30、40、50 ℃的穩定性Fig.11 Stability of lichi polyphenol and its microcapsules at 30, 40, 50 ℃

3 結論

本實驗通過復凝聚法制備了荔枝多酚微膠囊，并以包埋率為指標，采用正交試驗得出最優制備工藝：海藻酸鈉質量分數3.5%，氯化鈣質量分數3%，殼聚糖質量分數2.0%，包埋時間1 h，荔枝多酚質量分數0.8%，所得微膠囊的包埋率為95.74%。該膠囊近似球形，粒徑均一，外表不平滑，平均粒徑為1 mm。

體外釋放性能結果表明荔枝多酚微膠囊在不同pH下的多酚釋放曲線均符合一級動力學模型，在模擬腸液（pH6.86）中的多酚釋放率、ABTS+清除率及溶脹率最大，具有良好的靶向釋放性；且在相同的溫度條件下，荔枝多酚微膠囊較未包埋的荔枝多酚具有較高的多酚保留率，提高了2.09%~3.34%，表明荔枝多酚的微膠囊化可有效提高荔枝多酚的溫度穩定性。