Box-Behnken法優(yōu)化甘草多糖提取工藝及其體外抗氧化活性分析

柴美靈，李 娜，喬宏萍，劉 地，張曉紅，曹貴東，武曉英,

（1.太原師范學院生物系，山西晉中 030619；2.山西瑞象生物藥業(yè)有限公司，山西太原 030000）

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch），別名甜草根，豆科甘草屬，味甘而藥性平和，被稱為“國老”（眾藥之王），為藥食同源的中藥材，常被中醫(yī)處方入藥，同時也作為食品、保健品、化妝品等原料在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用[1]。甘草中主要含有三萜類、黃酮類、多糖類、香豆素類、揮發(fā)油類以及氨基酸等成分[2]，其提取物在抗炎、解毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面具有一定的藥理作用，也在保護神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面具有重要的研究意義[3]。甘草多糖是從甘草中提取出來的活性多糖，易溶于水，具有多種不同的功效，如調(diào)節(jié)機體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、防治骨關(guān)節(jié)炎等作用[4]。陳橙等[5]分離純化脹果甘草多糖，測定得到的3種酸性雜多糖均是由阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、半乳糖醛酸（GalA）以不同摩爾比組成；薛薇[6]將甘草多糖（GPS）降解衍生化后，通過氣質(zhì)色譜分析出GPS由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖三種單糖組成。

現(xiàn)有多糖提取技術(shù)有溶劑提取法、超聲輔助提取法、滲流-大孔樹脂循環(huán)耦合提取法、微波輔助提取、酶提法和超臨界二氧化碳（CO2）萃取技術(shù)等[7]。目前超聲提取技術(shù)在實驗中被廣泛應用，其原理是利用超聲波具有的空化效應、機械效應及熱效應，加速溶劑流動、滲透、溶解、擴散等，達到提取分離的目的，提取過程實際是對植物細胞破碎而加速植物成分的提取[8]，具有提取充分且效率高、提取處理量大且耗時短、提取溫度低且能耗小、提取成本低且效益高、提取物易于分離和純化和提取適應性廣泛等優(yōu)點[9]。

響應面試驗法（RSM）是利用合理的試驗設(shè)計，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題，有助于快速建模、縮短優(yōu)化時間和提高工程應用[10]。張光輝等[11]在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應面法優(yōu)化甘草多糖提取工藝，表明甘草多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度60.57 ℃、提取時間1.84 h、料液比1:30.92 g/mL，此條件下甘肅、內(nèi)蒙古、新疆甘草多糖得率分別為（19.89%±0.08%）、（11.25%±0.10%）、（9.60%±0.13%），當甘草多糖濃度為0.50 mg·mL?1時，甘肅、內(nèi)蒙古、新疆甘草多糖對DPPH自由基的清除率分別為 27.17%、31.69%、58.68%。李德龍等[12]在響應面優(yōu)化藥桑椹多糖超聲提取工藝研究中，表明多糖得率在提取3次時最高，分析可能是因為提取次數(shù)過多時多糖中的雜質(zhì)過多溶出導致得率下降，由此證明提取次數(shù)也是影響多糖提取工藝的因素之一，為接下來的研究提供有價值的參考。

本實驗主要采用超聲輔助水提取法，提取3次并分別測定每次提取的多糖含量，考察提取過程中的多糖變化趨勢，再利用Box-Behnken試驗設(shè)計獲得粉碎粒徑、液料比、超聲溫度、超聲時間對多糖得率的影響水平，得出最佳工藝參數(shù)；并采用DPPH與ABTS法在體外對其清除自由基的活性[13]進行初步研究，以期為甘草多糖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草藥材 山西瑞象生物藥業(yè)有限公司（產(chǎn)地：甘肅寧夏）；葡萄糖標準品、2, 2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 北京索萊寶科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇（批號：20200922）、苯酚（批號：20180328） 天津市大茂化學試劑廠；硫酸（批號：20100901） 四川西隴科學有限公司；以上試劑均為分析純（AR）。

BSA223S-CW型賽多利斯精密天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司；UF-123823H型超聲波清洗機 深圳市歌能超聲波重子聲學科技有限公司；SL-200型高速多功能粉碎機 浙江省永康市松青五金廠；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；V-1100型可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III型循環(huán)水式多用真空泵 上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 取一定量的甘草根切片，經(jīng)烘箱干燥后取出，由高速多功能粉碎機粉碎一定時間后，將其用不同孔徑大小的篩子篩出，分別用密封袋包裝儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 甘草多糖的提取 精密稱取干燥至恒重的不同粉碎粒徑的甘草粉末各1.0 g于50 mL離心管內(nèi)，按一定的液料比和超聲功率，在一定的溫度下反應一定的時間，待冷卻至室溫后離心，得甘草多糖提取液。

1.2.3 葡萄糖標準曲線繪制 采用苯酚-硫酸法[14]測定糖含量。精密稱取葡萄糖標準品4 mg于小燒杯溶解后轉(zhuǎn)到容量瓶中定容至25 mL，搖勻得0.16 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。精密吸取不同體積葡萄糖對照品溶液于潔凈的試管中，蒸餾水補足至0.2 mL，依次加入0.4 mL 5%苯酚和2.0 mL濃硫酸，搖勻后靜置反應30 min，以蒸餾水加入0.4 mL 5%苯酚和2.0 mL濃硫酸作為空白對照，于490 nm處測吸光值。以葡萄糖質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線[15]。

1.2.4 單因素實驗 單因素實驗分別考察粉粹粒徑（75、150、180、250、880 μm）、液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）、超聲溫度（35、45、55、65、75 ℃）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、超聲功率（200、400、600、800、1000 W）對甘草多糖得率的影響，各因素固定值分別為180 μm、20:1 mL/g、55 ℃、30 min、600 W。以上實驗分別提取3次，標記為1提、2提、3提，將3次提取液合并得合并液。

1.2.5 響應面優(yōu)化試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用Design Expert 10.Box-Behnken 試驗設(shè)計方案，以影響顯著的粉碎粒徑（A）、液料比（B）、超聲溫度（C）和超聲時間（D）為影響因素，以多糖得率為響應值，設(shè)計4因素3水平的29組實驗進行響應面試驗，優(yōu)化甘草多糖提取工藝，其因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Experimental factors and level of response surface design

1.2.6 甘草多糖得率計算 精密稱取甘草粉末1.0 g進行單因素實驗，超聲提取后過濾提取液、離心取上清液備用。以葡萄糖標準溶液繪制的標準曲線，來計算甘草多糖的多糖得率，實驗重復3次，取平均值，按照以下式（1）計算多糖得率[16]：

式中：c表示根據(jù)吸光度值計算出的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；v表示提取液體積，mL；n表示提取液稀釋倍數(shù)；m表示稱取的甘草粉末質(zhì)量，g。

1.2.7 甘草多糖對DPPH自由基清除能力的測定精確配制一定質(zhì)量濃度梯度的甘草多糖溶液，分別取每個濃度的多糖樣品溶液0.3 mL于刻度試管中，在避光條件下依次在試管中加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH乙醇溶液，室溫條件下避光反應30 min，以無水乙醇溶液為空白對照，以BHT為陽性對照[17]，于517 nm處測定溶液的吸光度值。所有實驗重復3次。根據(jù)式（2）計算多糖樣品對DPPH自由基的清除率，并計算半數(shù)抑制率IC50值[18]。

式中：A0表示0.3 mL蒸餾水+2.7 mL DPPH溶液的吸光度值；As表示0.3 mL樣品溶液+2.7 mL DPPH溶液反應后的吸光度值；Ar表示0.3 mL樣品溶液+2.7 mL無水乙醇溶液的吸光度值。

1.2.8 甘草多糖對ABTS自由基清除能力的測定精確配制7 mmol/L ABTS溶液與2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液，室溫下將兩者等體積混合，避光處反應12~16 h，獲得所需ABTS工作液備用，使用前以80%的乙醇稀釋，使其 734 nm處OD值為（0.7±0.02）。準確配制不同濃度的樣品溶液，分別取每個濃度的多糖樣品溶液0.3 mL于刻度試管中，在避光條件下依次在試管中加入2.7 mL ABTS溶液，室溫條件下避光反應30 min，于734 nm波長下測定吸光度值，無水乙醇調(diào)零，以BHT[16]為陽性對照。所有實驗重復3次。按式（3）計算甘草多糖對ABTS自由基的清除率，并計算半數(shù)抑制率IC50值[19]。

式中：A0表示0.3 mL蒸餾水+2.7 mL ABTS工作液的吸光度值；As表示0.3 mL樣品溶液+2.7 mL ABTS工作液反應后的吸光度值；Ar表示0.3 mL樣品溶液+2.7 mL無水乙醇溶液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗和抗氧化實驗數(shù)據(jù)采用Origin 9.1進行整理和繪圖；響應面試驗數(shù)據(jù)利用Design-Expert 10軟件中的Box-Behnken法進行回歸模型方程的建立及方差分析，實驗均重復三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

本實驗建立的葡萄糖標準曲線，其回歸方程為：y=8.3949x?0.0115，R2=0.9970，葡萄糖在 0~0.16 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。本實驗可根據(jù)該標準曲線方程計算甘草多糖中的多糖含量。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 粉碎粒徑對甘草多糖得率的影響 粉碎粒徑對甘草多糖得率的影響如圖1A所示，在3次提取過程中，多糖得率隨著粉碎粒徑的增大而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當粉碎粒徑為150 μm時，多糖得率最大?？赡苁且驗榉鬯榱竭^小時，物料過細，使甘草粉末易結(jié)塊，從而增加傳質(zhì)阻力使傳質(zhì)速率降低，不利于甘草多糖分子的溶出[20]，當粉碎粒徑繼續(xù)增大時，多糖得率降低，分析原因可能是粉碎粒徑過大，溶劑不能有效浸潤樣品，無法完全提取，因而得率降低[21]。因此選擇粉碎粒徑為150 μm。

2.2.2 液料比對甘草多糖得率的影響 如圖1B所示，在液料比10~30 mL/g范圍內(nèi)，1提與合并液的甘草多糖得率呈現(xiàn)先增大后減少后增大的趨勢；2提與3提的甘草多糖得率均呈現(xiàn)先增大后逐漸減小的趨勢。這可能是因為第一次提取時溶質(zhì)沒有完全浸透在溶液中，當溶液體積過小時，多糖在水中溶解不完全而且黏度過大；水體積超過20倍時，多糖在大量溶劑中的傳遞效果和傳熱效果受到影響[22]，此外，過高的液料比也可能會導致其他雜質(zhì)的溶出從而抑制多糖的溶出[23]，當液料比達到20 mL/g時，提取劑已經(jīng)達到飽和狀態(tài)，再增大液料比多糖得率反而會下降，因此選擇液料比20:1 mL/g為宜。

圖1 粉碎粒徑、液料比、超聲時間、超聲溫度和超聲功率對多糖得率的影響Fig.1 Effects of particle size, liquid-material ratio, ultrasonic time, ultrasonic temperature and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

2.2.3 超聲溫度對甘草多糖得率的影響 如圖1C所示，隨著超聲溫度增加，1提與合并液的多糖得率呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，且55 ℃時甘草多糖得率最高；2提與3提的甘草多糖得率均呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。這可能是由于：第一次提取時，隨著溫度的升高使分子運動加速了提取溶劑的滲入和細胞內(nèi)多糖的釋放，大部分多糖已經(jīng)釋放到溶質(zhì)中，但溫度過高會破壞多糖結(jié)構(gòu)[24]，尤其對高溫較敏感的多糖；當進行2次和3次提取時，大部分對高溫較敏感的多糖已經(jīng)遭到破壞，胞內(nèi)較少量的多糖可能對高溫不敏感，從而隨溫度的增大而逐漸釋放。因此，選擇溫度55 ℃為宜。

2.2.4 超聲時間對甘草多糖得率的影響 如圖1D所示，隨著超聲時間的延長，1提與合并液的多糖得率呈現(xiàn)先增大后減少后增大的趨勢，當提取時間30 min時達到最大；2提與3提的甘草多糖得率均呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢。其原因可能是在第一次提取的過程中，甘草物料所含多糖在短時間內(nèi)不能完全溶解釋放，但隨著提取時間的延長，較多的多糖逐漸溶解并釋放到溶質(zhì)中，使得得率提高，當提取時間繼續(xù)增加，持續(xù)的高溫與超聲作用可能在一定程度上破壞多糖分子的結(jié)構(gòu)，使多糖降解為單糖[25]。因此，選擇最佳提取時間為30 min。

2.2.5 超聲功率對甘草多糖得率的影響 如圖1E所示，隨著超聲功率的增加，1提的甘草多糖得率逐漸增大，2提、3提以及合并液的多糖得率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，可能是由于在第一次提取過程中，甘草細胞壁首次遭到超聲波的破壞，隨著功率的增大，越來越多的細胞遭到破壞，多糖分子被逐漸釋放到溶質(zhì)中，而在2提和3提的過程中，大多數(shù)甘草細胞壁已經(jīng)在超聲的過程中被破碎，隨著超聲功率的增大，超聲波直接作用于多糖分子，大分子多糖在超聲波的強剪切作用下發(fā)生斷裂，導致多糖得率降低[26]，因此選擇超聲功率600 W為宜。

通過以上單因素實驗分析且綜合考慮多糖得率及實驗成本等因素，最終確定甘草多糖提取的最佳基本條件為：粉碎粒徑150 μm、液料比20:1 mL/g、超聲溫度55 ℃、超聲時間30 min和超聲功率600 W。在以上5個單因素中，除超聲功率外，其余4個因素對甘草多糖得率的影響范圍均大于1%，因此，將粉碎粒徑、液料比、超聲溫度和超聲時間作為Box-Behnken響應面試驗設(shè)計的優(yōu)化參數(shù)。

2.3 響應面優(yōu)化提取工藝結(jié)果與分析

2.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken試驗設(shè)計對甘草多糖提取工藝進行優(yōu)化，選擇超聲波功率600 W作為響應面優(yōu)化恒定條件，對粉碎粒徑、液料比、溫度、時間4個影響顯著的因素進一步優(yōu)化，以多糖得率為評定指標，試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

采用Design-Expert 10軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行響應面回歸擬合，得到甘草多糖得率響應值（Y）和各因子（A、B、C、D）之間的二次回歸模型為：

表2 甘草多糖提取得率的Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results of the extraction rate of Glycyrrhiza polysaccharides

Y=8.98?0.75A?0.10B+1.67C+0.055D+0.080AB?0.80AC+0.045AD+0.041BC?0.17BD+（ 2.500E-010）CD-1.00A2?0.47B2?0.64C2?1.31D2。對該方程的回歸分析和方差分析如表3所示。

由表3可知，二次多項式擬合模型極顯著（P<0.0001），F(xiàn)值為 9.85，表明此模型極為顯著，即各因素與其響應值之間有著極為顯著的相關(guān)性。其失擬項P=0.0955>0.05并不顯著，表明在實驗范圍內(nèi)，該模型與實驗數(shù)據(jù)的擬合性較好；擬合系數(shù)R2值為0.9078，可以認為模型解釋了90.78%響應值的變化。由此說明，該模型可對甘草多糖得率進行分析和預測。

如表3所示，由F值可知單因素對甘草多糖得率的影響順序依次為：C（超聲溫度）>A（粉碎粒徑）>B（液料比）>D（超聲時間），一次項A和C差異極顯著（P<0.01），一次項 B 和 D 不顯著（P>0.05）；交互項 AC顯著（P<0.05），AB、AD、BC、BD和 CD不顯著（P>0.05）；二次項 A2和 D2極顯著（P<0.01），C2顯著（P<0.05）。這表明粉碎粒徑和超聲溫度這兩個因素對甘草多糖得率具有顯著的影響，其交互作用也對多糖得率具有顯著的影響。

表3 響應面方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.3.2 模型準確性分析 實驗數(shù)據(jù)的殘差和響應設(shè)計如圖2所示。圖2A顯示了不同水平甘草多糖響應值的殘差正態(tài)分布概率圖，由圖可知，29組響應值較為合理地分布于一條直線兩側(cè)，且其方差無偏差顯示。本實驗的實驗值與預測值非常接近（圖2B），表明本實驗所建立的模型成功地加強了四個變量參數(shù)與響應之間的聯(lián)系。通過建模擬合，對內(nèi)部學生化殘差與29組實驗運行數(shù)據(jù)進行分析（圖2C），結(jié)果顯示，所有數(shù)據(jù)點都位于極值之間，所有杠桿點的值都小于1，處于樣本空間中心，表明實驗模型中沒有有效誤差存在（圖2D）。相反，由dfbeta值差異圖（圖2E）可知，29組運行數(shù)據(jù)對其回歸系數(shù)都沒有顯著影響；Cook’D用來發(fā)現(xiàn)對統(tǒng)計量影響較大的實驗數(shù)據(jù)元素，圖2F顯示，Cook’D的值在確定的范圍內(nèi)，說明29組實驗數(shù)據(jù)中沒有影響模型的觀察值。通過以上回歸診斷分析，說明本實驗建立的甘草多糖提取工藝模型準確性較高，可以用于甘草多糖的提取制備。

圖2 Box-Behnken 模型準確性診斷圖Fig.2 Diagnostic plots for the Box-Behnken model accuracy

2.3.3 交互作用分析 三維響應面圖和等高線圖是Box-Behnken響應面法建立的多元非線性模型和回歸方程的直觀表示[27]，其等高線形狀的橢圓化程度與兩因素交互作用的顯著程度呈正相關(guān)，橢圓化程度越大，說明交互作用越顯著[28]。

由圖3可知，等高線近似橢圓，曲面圖陡峭，說明二者的交互作用顯著，結(jié)合表3中的方差分析顯示，粉碎粒徑與超聲溫度對多糖得率的交互作用與數(shù)據(jù)擬合較好，且隨著超聲溫度的增加，多糖得率逐漸增大，而多糖得率隨著粉碎粒徑的增大則表現(xiàn)為先增大后減小的趨勢，當粉碎粒徑為126.57 μm時，多糖得率最高。

圖3 粉碎粒徑與超聲溫度交互作用對多糖得率的影響Fig.3 Effect of particle size and ultrasonic temperature on extraction rate of polysaccharides

2.3.4 最佳提取工藝參數(shù)優(yōu)化及驗證 采用Design-Expert 10軟件預測超聲輔助提取甘草多糖的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果顯示甘草多糖提取的最佳工藝參數(shù)為粉碎粒徑 126.57 μm，液料比 19.3175 mL/g，超聲溫度65 ℃，超聲時間30.1732 min，此條件下，甘草多糖的得率最高，預測值為10.6237%。為方便實驗，在粉碎粒徑 127 μm，液料比 19.32 mL/g，超聲溫度65 ℃，超聲時間30.2 min的條件下進行驗證實驗。上述實驗條件下得到的甘草多糖的得率為（10.867%±0.53%），與理論預測值比較接近（RSD=0.179%），說明用該模型可以較好地反映甘草多糖提取的條件。

2.4 甘草多糖的抗氧化活性測定

2.4.1 甘草多糖對DPPH自由基清除能力的測定如圖4A所示，隨著甘草多糖質(zhì)量濃度增大，其對DPPH自由基清除率也隨之升高，當濃度達到6 mg/L時曲線趨于平緩，表明在一定濃度范圍內(nèi)，甘草多糖對DPPH自由基清除能力與其濃度呈劑量效應關(guān)系，其最大清除率為91.00%，半數(shù)抑制率IC50值為2.80 mg/mL。在實驗濃度范圍內(nèi)，BHT對DPPH自由基具有清除能力，且其清除率隨著BHT濃度的增大而呈現(xiàn)增大的趨勢，BHT對DPPH自由基清除能力的 IC50值為 4.10 μg/mL，其最大清除率高達95.89%。通過對比甘草多糖和BHT對DPPH自由基的清除作用可知，甘草多糖對DPPH自由基的清除效果顯著弱于化學合成的抗氧化劑BHT。

圖4 甘草多糖對DPPH自由基（A）和ABTS自由基（B）的清除率Fig.4 Clearance of DPPH radical（A）and ABTS radical（B） by crude polysaccharides from Glycyrrhiza

2.4.2 甘草多糖對ABTS自由基清除能力的測定如圖4B所示，在實驗濃度范圍內(nèi)，隨著甘草多糖和BHT濃度的增加，二者對ABTS自由基清除能力均呈現(xiàn)對數(shù)增加趨勢，二者對ABTS自由基清除能力的 IC50值分別為 1.96 mg/mL和 1.36 μg/mL，最大清除率分別為85.59%（甘草多糖濃度為6 mg/mL）和99.65%（BHT濃度為8 μg/mL）。由此可見，實驗所制備的甘草多糖對ABTS自由基具有清除作用，且其清除能力與甘草多糖濃度呈量效關(guān)系，但實驗所制備的甘草多糖對ABTS自由基清除能力顯著低于BHT，二者對ABTS自由基清除能力存在數(shù)量級差異。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助提取技術(shù)，設(shè)計單因素實驗和響應面優(yōu)化甘草多糖提取工藝，利用軟件建立回歸模型預測甘草多糖的最佳提取工藝條件，實驗條件下得到的甘草多糖的得率為（10.867%±0.53%）。通過體外抗氧化實驗表明，實驗制備的甘草多糖對DPPH自由基和ABTS自由基均有清除作用，且清除能力的強弱與多糖樣品濃度存在量效關(guān)系，當甘草多糖提取物濃度為14 mg/mL和6 mg/mL時，分別對DPPH自由基和ABTS自由基清除效果最好，清除率分別為 91.00%、85.59%，其 IC50值分別 2.80 mg/mL和1.96 mg/mL，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。其創(chuàng)新之處在于分別測定三次提取液及合并液的多糖得率，優(yōu)化出最佳提取工藝，使甘草提取物充分釋放，有效避免了資源的浪費。

近年來，隨著對中草藥藥效作用要求的提高，對中藥提取工藝的技術(shù)研究也越來越受重視，然而在提取工藝上還存在一些問題，例如提取甘草以多糖得率為指標，其提取方法不同，劑量差異也較大，提取次數(shù)和提取量都會影響得率，提取工藝不同其化學組分含量也不一致，因而提取次數(shù)對甘草多糖的化學組分造成的差異還有待于進一步實驗研究。