溶藻弧菌噬菌體Va2001的分離鑒定及其應用

朱秋華，張 健，王麗衛，董 浩，曾仙童，郭曉華，申照華，宋 鋼，張德福, ，張 明, ，勵建榮,

（1.渤海大學食品科學與工程學院, 渤海大學海洋研究院, 遼寧省食品安全重點實驗室, 生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心, 遼寧錦州 121013；2.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室, 北京 100190；3.山東美佳集團有限公司, 山東日照 276800；4.錦州市龍海馨港科技有限公司, 遼寧錦州 121211；5.凌海市達蓮海珍品養殖有限責任公司, 遼寧錦州 121211）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是海洋環境中常見的一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌，屬于弧菌科弧菌屬[1?2]。該菌主要分布在海域和河口地區，是水產動物的主要致病性弧菌之一。據報道，溶藻弧菌可感染蝦、牡蠣、貝類等，給全球水產品養殖業造成重大的經濟損失，這種現象已經阻礙了水產養殖業的穩定發展[3]。在水產領域傳統的殺菌消毒的方式是使用抗菌藥物和化學消毒劑，但長時間使用抗菌藥物會使細菌產生耐藥性，導致嚴重的病害，而且藥物殘留還會產生食品安全問題[4]。因此，尋找綠色、健康的生物防治劑抑制水產品養殖環境中的致病菌對保持水產品的健康及食品安全具有重要意義。

噬菌體（bacteriophage）是能感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱[5]。噬菌體存在于多種生態環境中，種類繁多，數量巨大，達到1031（約為細菌數量的 10 倍）[6?7]。20 世紀初，噬菌體由英國微生物學家Frederick Twort 和加拿大微生物學家 Felixd’Herelle 發現[8?9]。噬菌體在治療動物、植物中的細菌性疾病、水產動物體內凈化等方面有獨特的應用優勢[10?11]，尤其是自國家提倡“無抗養殖”以來，噬菌體作為抗菌藥物的替代品重新引起人們的重視。噬菌體在污水方面的應用有，它可對水體環境進行消毒（如噬菌體PTCC1399和SBSWF27處理城市污水等），可作為傳感器監測水體、用于治理活性污泥絲狀膨脹等[12]。因此，噬菌體可用于細菌性疾病的防控。

本研究從錦州市水產品市場、超市、農貿市場、筆架山海域、葫蘆島市某水產養殖場、鞍山市某養殖場等采集的約60份海產品及其養殖環境污水中分離獲得一株溶藻弧菌噬菌體Va2001，并且對其基本的生物學特征和應用進行了研究，為制備溶藻弧菌的新型清除劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品來源 錦州市水產市場、農貿市場、筆架山海域、超市及葫蘆島某水產養殖場、鞍山某養殖場的海產品及其養殖的污水；硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 天津博迪化工股份有限公司；氯化鈉 美國MP公司；Tris-HCl 北京索萊寶科技有限公司；明膠 國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉、LB培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；2216E液體培養基 青島高科園海博生物技術有限公司；Φ0.45 μm、Φ0.22 μm針孔過濾器 天津津騰實驗設備有限公司。

5417R小型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；GI54DS自動壓力蒸汽滅菌器 致微（廈門）儀器有限公司；SPX-250生化培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養 將?80 ℃保存的溶藻弧菌在含3.5% NaCl（以下方法中所描述的LB液體培養基均含3.5% NaCl，不再贅述）固體LB平板上劃線接種，28 ℃培養10 h，挑取溶藻弧菌單菌落接種于10 mL的LB液體培養基中，28 ℃條件下130 r/min振蕩培養10 h。

1.2.2 樣品采集 采集60份海產品及其養殖環境污水，之后置于無菌采樣袋中帶回實驗室，4 ℃保存備用。

1.2.3 噬菌體的分離純化 參考Gencay等[13]的方法進行改進。將采集的海產品加入適量生理鹽水勻漿后同污水樣品都進行8000 r/min離心30 min，上清液經0.45 μm過濾器過濾，收集濾液。取40 mL濾液，加入10 mL LB液體培養基，同時加入10 mL對數生長期的溶藻弧菌，在28 ℃條件下130 r/min振蕩培養10 h。次日，培養物4 ℃ 8000 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm針頭過濾器過濾，收集濾液。將濾液 10 倍梯度稀釋至 10?1~10?8，取 500 μL各個樣品的梯度稀釋液和等體積的溶藻弧菌菌液混合，室溫靜置10 min。將上述混合液傾注雙層平板，平板凝固后28 ℃倒置培養8 h。挑取單個噬菌斑置于 1 mL SM緩沖液（1 g/L明膠，0.1 mol/L NaCl，8 mmol/L MgSO4，1 mol/L Tri-HCl（pH7.5））的離心管中，4 ℃放置8 h。此步驟重復培養3~5次，使噬菌斑的形態一致，得到噬菌體液備用。

1.2.4 噬菌體的電鏡觀察 參考文獻[14]，采用3%醋酸鈾負染色法對噬菌體進行染色。首先對噬菌體增殖液進行純化，分別取100 μL噬菌體液（效價1010PFU/mL）、3%醋酸鈾分別滴在盛有潔凈封口膜的玻璃皿中。將銅網浸沒在噬菌體液中，懸浮10 min，用濾紙緩慢吸干銅網上的水分。將銅網在3%的醋酸鈾染料中負染5 min，用濾紙吸走多余的液體，室溫下自然晾干。用JEM1200EX透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態。

1.2.5 噬菌體裂解譜的測定 裂解譜測定采用雙層平板的方法并加以改進[15]。取200 μL溶藻弧菌菌液與4 mL約50 ℃的2216E半固體培養基混合均勻，傾倒在下層固體瓊脂培養基上。待上層半固體培養基凝固后，取100 μL噬菌體液均勻滴在平板上。待上層液體全部吸收后將雙層平板倒置在28 ℃培養箱中培養8 h，觀察平板上是否有噬菌斑產生。

1.2.6 噬菌體最佳感染復數（MOI）測定 感染復數是指噬菌體和細菌細胞數量的比值。將噬菌體和溶藻弧菌按照 MOI=1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001、0.00000001比例分別加入10 mL的LB液體培養基中，在28 ℃條件下130 r/min振蕩培養10 h。培養液8000 r/min離心10 min，經0.22 μm針孔過濾器過濾，參照Addy等[16]的方法用雙層平板法測定其效價。每組實驗進行三次重復。

1.2.7 噬菌體的一步生長曲線 一步生長曲線的測定的指標有三個分別是潛伏期（噬菌體吸附宿主細菌后釋放子代噬菌體的時間）、爆發期（噬菌體開始釋放至完全釋放子代噬菌體的時間）、裂解量（宿主細菌被感染后子代噬菌體的釋放的量）。參照Kabwe等[17]的方法，略加改進。具體步驟如下：取1 mL活化的溶藻弧菌菌液，按MOI=0.0001加入噬菌體Va2001，28 ℃ 培養箱中孵育 10 min，8000 r/min離心10 min，棄上清，用2 mL LB液體培養基重懸沉淀，重復上述操作三次后，然后依次等量分裝至離心管中，28 ℃條件下130 r/min振蕩培養，此刻時間記為 T0=0，每隔 10 min 取培養液 200 μL，經 0.22 μm針頭過濾器過濾后用雙層平板法測定其效價。使用Origin 9.0以感染時間為橫坐標，噬菌體的效價為縱坐標，繪制一步生長曲線，裂解量的計算按照如下公式進行計算。

1.2.8 噬菌體的熱穩定性 各取1 mL噬菌體液體（效價達1010PFU/mL）于無菌的Ep管中，分別放入4、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80 ℃ 的水浴鍋中，不同溫度下孵育1 h后，立即進行冰浴，雙層平板法測定噬菌體的效價。實驗進行3次重復。

1.2.9 噬菌體pH的穩定性 用氫氧化鈉和鹽酸將10 mL LB液體培養基調pH1~13，分別加入1 mL噬菌體（效價達1010PFU/mL），28 ℃條件下孵育1 h，雙層平板法測定噬菌體效價。每組實驗分別進行三次重復。

1.2.10 溶藻弧菌噬菌體Va2001的初步應用 參考Zhang和Ren[3,18]的方法略加修改。以牡蠣為感染模型測定噬菌體對溶藻弧菌的清除作用。購買海水精配制人工海水，海水精X的用量計算方法見下文公式。在裝有人工海水的水箱中充氣24 h以上進行除氯，之后用臭氧（3 L/min）對人工海水進行除菌。

式中：X為海水晶的用量；水體當前的鹽度及水體重量均為已知。

將購買的活體牡蠣暫養24 h后挑100只牡蠣分為5個處理組，每組20只：第1組，空白對照組，保持暫養狀態，不添加人工污染細菌，不添加噬菌體；第2組，陽性對照組，人工污染細菌，不添加噬菌體，在人工海水中加入溶藻弧菌菌液至終濃度為1×106CFU/mL，第3~5組感染相同濃度的細菌；第3組，人工污染細菌/噬菌體處理組，MOI=1；第4組：人工污染細菌/噬菌體處理組，MOI=0.1；第5組：人工污染細菌/噬菌體處理組，MOI=0.01。

在設置組別的過程中，因實際的應用過程中，噬菌體需要大量制備，最佳感染復數越低時，實驗過程的濃度不易控制，為了避免數據有較大的誤差，選擇易于控制的MOI，且趨向于最佳感染復數值，研究不同的MOI對溶藻弧菌的控制的效果。每組設置三個平行組，每隔6 h觀察不同的感染復數對牡蠣的保護效果，記錄并統計牡蠣的成活率，計算如下。

式中：Y為牡蠣的成活率；牡蠣的累計死亡數量通過實驗過程中統計的數量進行計算。

每組每隔12 h取出三只牡蠣，將其去殼后，牡蠣肉的重量為（50±0.1）g，放置于無菌的均質袋中，拍打均質后，用平板計數法統計牡蠣中的溶藻弧菌的數量，拍打均勻后的牡蠣肉混合液經0.22 μm 濾膜過濾后，雙層平板法測定噬菌體的效價。每組每隔12 h取2 mL的人工海水于無菌的Ep管中，用以上相同的方法測定溶藻弧菌和噬菌體的數量。每組實驗設置三次重復。

1.3 數據處理

實驗數據用SPSS 19.0統計學軟件進行處理（利用Duncan檢驗，以P<0.05為差別有統計學意義），用Origin 9.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 噬菌體的分離純化

如圖1所示，以實驗室保存的溶藻弧菌為宿主菌，從錦州市水產市場、農貿市場、筆架山海域、超市及葫蘆島某水產養殖場、鞍山某養殖場等地方采集的約60份海產品及其養殖環境污水中分離到一株溶藻弧菌噬菌體，命名為Va2001。挑取單個噬斑用雙層平板法，純化噬菌斑3~5次后，得到Va2001的噬菌斑圓形透明，形態大小基本保持一致，培養10 h后形成直徑約0.32 mm的噬菌體斑。

圖1 噬菌體Va2001的噬菌斑Fig.1 Bacteriophage plaques formation of Va2001

2.2 噬菌體的電鏡觀察

噬菌體Va2001經過負染后，透射電鏡下噬菌體的形態如圖2。透射電鏡下噬菌體的照片顯示為有尾的，頭部形態為六邊形，直徑約(46±5)nm，尾部不可收縮，尾長約(17±2)nm，尾寬約(10±1)nm。按照噬菌體的形態學分類，推斷該噬菌體為有尾噬菌體目(Caudovirales)，自復制亞科中的短尾噬菌體科（Podoviridae）。

圖2 噬菌體Va2001的電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy of Va2001

2.3 噬菌體裂解譜的測定

結合雙層平板法測定噬菌體Va2001的裂解譜，結果如表1所示，所有受試菌株中，噬菌體對16株溶藻弧菌表現出陽性噬菌斑，對副溶血性弧菌、坎式弧菌、輪狀弧菌等均表現為陰性。這表明，該株噬菌體僅能夠裂解種內的不同分離源的溶藻弧菌，不能裂解其他分離源的弧菌。這表明本次實驗分離的噬菌體Va2001對宿主菌有高度的專一性。

表1 噬菌體Va2001的裂解譜Table 1 Analysis of bacteriophage Va2001 host rang

2.4 噬菌體最佳感染復數（MOI）測定

用不同滴度的噬菌體Va2001感染宿主菌，用雙層平板法測定培養后的噬菌體效價，最佳感染復數的結果如表2所示。該噬菌體Va2001的最佳MOI是0.0001。

表2 噬菌體Va2001最佳感染復數的測定Table 2 Optimal multiplicity of infection determination of bacteriophages Va2001

2.5 噬菌體的一步生長曲線

以最佳感染復數（MOI=0.0001）測定噬菌體Va2001的一步生長曲線，它的增殖規律大體呈現“S”型（圖3）。噬菌體Va2001的潛伏期約是20 min，爆發期約是100 min，裂解量274 PFU/cell，一個裂解周期大約是120 min。

圖3 噬菌體Va2001的一步生長曲線Fig.3 One-step growth curve of bacteriophages Va2001

2.6 噬菌體的熱穩定性

噬菌體Va2001的熱穩定性顯示（圖4），噬菌體Va2001的活性在4~35 ℃較穩定，效價為1010PFU/mL，在40~60 ℃時，噬菌體效價下降約1 lg PFU/mL；但噬菌體滴度達109PFU/mL，70 ℃處理后，噬菌體仍有一定的活性，但80 ℃處理后噬菌體全部失活。

圖4 溫度對噬菌體Va2001效價的影響Fig.4 Effect of temperature on bacteriophage Va2001 viability

2.7 噬菌體的pH穩定性

噬菌體Va2001在不同pH條件下的穩定性（圖5）表明，在 4 ≤pH≤ 9范圍，噬菌體 Va2001效價在108PFU/mL以上；在pH10和pH11條件下，噬菌體 Va2001效價略有下降。但是，當pH≤2和pH≥13，噬菌體Va2001喪失活性。

圖5 pH對噬菌體Va2001效價的影響Fig.5 Effect of pH on bacteriophage Va2001 viability

2.8 噬菌體對牡蠣中溶藻弧菌的凈化

應用牡蠣感染模型評價噬菌體Va2001對溶藻弧菌的清除效果，結果如下圖所示。圖6是不同的感染復數對牡蠣的保護效果，不同濃度的噬菌體對其保護效果不同。與對照組相比，隨著養殖時間的延長，實驗組（MOI=1、MOI=0.1、MOI=0.01）中牡蠣的成活率不斷降低；感染復數越高，牡蠣的死亡率減少的快，但長時間作用后，低濃度組更能顯著(P<0.05)減少牡蠣的死亡。在第3 d時牡蠣的成活率均能接近85%；第4 d開始，成活率低于80%以下；在第10 d時，牡蠣的成活率在10%以下，說明在牡蠣在可控制的因素范圍內，以牡蠣為感染模型應用于小型實驗中是可行的。

圖6 噬菌體Va2001不同的感染復數對牡蠣的保護效果Fig.6 Cumulative mortality of oysters at different V.alginolyticus bacteriophage Va2001 concentrations

圖7（a）是養殖環境中溶藻弧菌數量的變化，與單獨添加溶藻弧菌的處理組相比，在人工污染細菌/噬菌體處理組中溶藻弧菌的數量降低。當時間延長至 48 h，實驗處理組（MOI=1、MOI=0.1、MOI=0.01）中的溶藻弧菌的數量顯著(P<0.05)降低；到72 h時，MOI=0.1和MOI=0.01組中溶藻弧菌的數量約降低1×102CFU/mL。圖7（b）中牡蠣體內溶藻弧菌數量的變化趨勢與養殖環境中的一致。結果表明，高濃度的噬菌體Va2001處理組與低濃度組相比，前者比后者的溶藻弧菌的數量顯著(P<0.05)降低，當延長培養時間至72 h，噬菌體Va2001低濃度處理組中溶藻弧菌的數量約下降2個數量級。說明噬菌體Va2001能夠清除牡蠣體內的溶藻弧菌；與高濃度處理組相比，低濃度組所需的噬菌體用量較少，更經濟。

圖7 牡蠣感染模型中噬菌體Va2001應用后溶藻弧菌數量的變化Fig.7 Number change of V.alginolyticus in oyster infection model by using bacteriophage Va2001

圖8（a）是養殖環境中噬菌體Va2001數量的變化，結果顯示，隨著培養時間的延長，噬菌體Va2001的數量上升。實驗組（MOI=1、MOI=0.1、MOI=0.01）中噬菌體數量明顯升高；當作用72 h，噬菌體數量約提高1×102PFU/mL。圖8（b）是牡蠣體內噬菌體數量的變化，其變化趨勢與環境中的基本保持一致。當培養時間延長，噬菌體的數量呈現上升的趨勢，這是因為在養殖環境中宿主菌被噬菌體侵染，釋放了子代噬菌體；在流體環境中能加速噬菌體的擴散的能力，若牡蠣在試驗過程是活著的狀態，每隔一定的時間，殼處于伸張閉合狀態，另一方面，在取樣期間，用蠔刀去殼時很吃力，這能夠表明牡蠣是活著的狀態，從而噬菌體能夠清除牡蠣體內的溶藻弧菌，因此，以上現象說明噬菌體數量的升高是由于裂解養殖環境中溶藻弧菌的緣故，同時也證明在取樣期間，牡蠣處于存活的狀態。

圖8 噬菌體Va2001應用在牡蠣感染模型中噬菌體數量的變化Fig.8 Number change of bacteriophages in oyster infection model by using bacteriophage Va2001

3 討論與結論

噬菌體廣泛分布在海水、污水、土壤中，是生態系統中最豐富的生物[6?7,19?20]。因此，噬菌體可以從環境樣本中分離得到，如溶藻弧菌噬菌體、副溶血性弧菌噬菌體、嗜水氣單胞菌噬菌體、柱狀黃桿菌噬菌體、銅綠假單胞菌噬菌體等[18,21?26]。

按照噬菌體形態學的分類，目前文獻已經報道溶藻弧菌噬菌體的形態有多種，其中包括肌尾噬菌體科（Myoviridae）[14,27]、短尾噬菌體科（Podoviridae）[28]，本研究中分離到的溶藻弧菌噬菌體Va2001屬于有尾噬菌體目，短尾噬菌體科。據相關文獻報道，以相同細菌為宿主，在不同地點分離的噬菌體的生物學特征可能是不同的[29?30]。本研究中的裂解譜結果顯示，實驗過程中分離到的噬菌體Va2001的裂解譜范圍較窄，但其能對宿主菌形成透亮的噬菌體斑，說明它具有高度的特異性。但是可以通過其他的方式如基因編輯、雞尾酒療法等方式解決噬菌體的裂解譜窄的問題，本文中的噬菌體有待于用其他的方法拓寬裂解譜，來殺滅其他的細菌[6,31?33]。本研究中利用噬菌體Va2001對宿主菌的特異性，為其在致病菌的檢測方面奠定理論基礎。

測定最佳感染復數可以指導噬菌體制劑等方面的研究。不同噬菌體的感染復數是不相同的。Kalatzis等[34]分離的溶藻弧菌噬菌體 phiSt2和phiGrn1的最佳感染復數（MOI）分別是 10、100；Lin等[1]報道的噬菌體ФA318最佳感染復數為0.1，本研究中的噬菌體最佳感染復數（MOI）是0.0001，相比較而言，本實驗中的噬菌體Va2001有較強的裂解能力。因此在實際應用中所需的用量更少；同時，一步生長曲線測定結果顯示潛伏期約是20 min，裂解期約是100 min，裂解量274 PFU/cell，說明噬菌體Va2001的裂解效率高，可降低制備噬菌體制劑的生產成本。

在測定噬菌體Va2001溫度敏感性過程中，噬菌體的效價在70 ℃驟降，溫度高于80 ℃，噬菌體失活，與Constantina等[35]研究的噬菌體VEN 的結果一致。這一結果說明溫度過高，可能會使噬菌體的結構發生改變，從而造成噬菌體的裂解性能降低。噬菌體Va2001在pH4~9范圍內，穩定性高；在pH12時，噬菌體有一定的活性；在pH≤2和pH≥13，噬菌體失活，表明在強酸或者強堿的環境中不能存活，這與Kim等[15]研究噬菌體pVa-21結果基本一致。本實驗中分析噬菌體對溫度和pH的耐受性，可以為噬菌體制劑的生產及應用提供指導作用。用噬菌體凈化牡蠣體內的溶藻弧菌結果顯示：不同的感染復數對牡蠣的保護效果是有差異性的，并且其在裂解人工海水中的溶藻弧菌的同時也能夠清除牡蠣體內的溶藻弧菌，為海產品中溶藻弧菌的清除劑的開發提供依據。