大果白刺多糖的物理特性及抗氧化活性研究

吳瀟霞，陳 楠，白冰瑤，張 麗，陳計巒，宋麗軍,

（1.石河子大學食品學院, 新疆石河子 832000；2.塔里木大學生命科學學院, 新疆阿拉爾 843300；3.蚌埠學院食品與生物工程學院, 安徽蚌埠 233030）

大果白刺隸屬于蒺藜科（Zygophllaceae）白刺屬（Nitrarial）。白刺屬有13個種，其中有8個品種分布在我國[1]。白刺屬廣泛分布于歐洲、澳大利亞、亞洲、非洲和中國的青海、西藏、新疆、甘肅、內蒙等地的湖盆區域和風沙地帶[2]。白刺具有耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠和抗風沙等特點[3]。大果白刺是一種藥食同源的植物果實，果實可制作沙櫻桃飲料、蘭刺飲料，也可入藥。據全國中草藥匯編記載，白刺果實，味甘酸，性溫，具有健脾胃，養血調經，安神解表的功能[4]。白刺中含有豐富的氨基酸、維生素等營養物質及多種微量元素[2]，具有很高的營養、經濟和生態價值，近年來引起廣泛關注。

多糖（polysaccharide）是由10個及以上的醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的大型高分子有機聚合物[5]。多糖廣泛存在于植物材料中，并被證明具有多種生物活性，例如抗氧化[6]、抗腫瘤、免疫調節[7]、抗降血糖和降血脂活性[8]。現代研究表明白刺具有抗氧化、抗菌、降血糖降血脂等多種生物活性。生物活性歸因于多種活性成分，例如多糖、維生素、三萜類、黃酮和多酚[9]。例如，從小果白刺葉中提取的活性生物堿可以抑制細菌的生長[10]。白刺果實的提取物具有抗氧化和抗菌活性，對肉制品具有一定的保鮮作用[11]。此外，不同種類的白刺具有多種藥理活性，例如西伯利亞白刺可以降血壓[12]、唐古特白刺可以抗心律不齊、抗痙攣、降血脂[13]。植物來源的多糖還具有強大的親水性，理想的流變特性以及良好的功能特性（例如膠凝、起泡、乳化和增稠），因此廣泛應用于食品添加劑及化妝品行業。先前的研究表明，阿拉伯樹膠中的共價耦合蛋白是其優良乳化性能的關鍵[14]。由于銀耳多糖良好的保濕性和凝膠特性，研發出銀耳多糖涂抹型面膜[15]。

目前對白刺果的純化組分的結構、生物活性及構效關系的研究較多，但對大果白刺多糖的物理特性研究較少。本文以新疆野生白刺果為原料，經過水提醇沉分離其中的多糖，并對其物理特性進行測定，同時探究其體外抗氧化活性，以期為白刺果多糖應用于功能性食品、生物醫學和制藥等行業提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生大果白刺果實 于2019年6月采自新疆塔克拉瑪干沙漠邊緣地區；總抗氧化試劑盒、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、乙腈、抗壞血酸、單糖標準品（葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、木糖和巖藻糖） 均購于北京索萊寶生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）及其他有機溶劑和藥品 均為國產分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；大豆油金龍魚。

Agilent高效液相色譜 美國安捷倫科技有限公司；STA-449 F3差示熱重分析儀 德國NETZSCH公司；MCR702e流變儀 美國博勒飛公司；FC多功能酶標儀 美國賽默爾公司；CR21高速離心機 日立有限公司；XW-80A渦旋混合器 上海精科實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大果白刺多糖的提取 大果白刺清洗晾干，去籽，40 ℃烘箱烘干，粉碎過60目篩。稱取大果白刺粉末300 g，根據前期的試驗，以1:20的料液比加入蒸餾水，80 ℃恒溫水浴提取5 h，提取三次，收集上清液，60 ℃減壓濃縮至原來體積的四分之一，加入4倍體積的無水乙醇于4 ℃冰箱過夜，5000 r/min離心15 min，收集沉淀，?60 ℃真空冷凍干燥30 h得到大果白刺粗多糖（CNRFP）。

1.2.2 大果白刺多糖的基本化學成分測定 采用苯酚硫酸法測定總糖含量[16]，以葡萄糖為標準品。線性回歸方程為 Y=8.384X?0.0131（R2=0.9987）。采用m-間羥基聯苯比色法測定己糖醛酸含量，以半乳糖醛酸為標準品[17]。線性回歸方程為Y=9.857X+0.0159（R2=0.9994）。采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準品[18]，得到的線性回歸方程為 Y=5.239X?0.0201（R2=0.9987）。根據線性回歸方程計算粗多糖中的基本化學成分含量。

1.2.3 大果白刺多糖的單糖組成 采用高效液相色譜法（HPLC）中PMP衍生法分析白刺果多糖的單糖組成[19]。混標的制備和衍生：在真空密封管中，將各單標和混標溶解，配制濃度為1.0 mg/mL標準溶液，精確吸取250 μL混合標準溶液到5 mL EP管中，加入 250 μL 0.6 mol/L NaOH，500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇，70 ℃反應1 h。冰水中冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mo1/L HC1溶液終止反應，再加入1 mL氯仿漩渦l min，3000 r/min離心10 min，小心取上清，萃取3次。通過 0.22 μm膜過濾，并對 5 μL濾液進行HPLC分析。

色譜條件：Ultimate 3000系列高效液相色譜系統配備二極管陣列檢測器和xtimate C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）毛細管柱，柱流動相為 0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.7），83%（溶液 A）和 17%乙腈（溶液B）。流速為1.0 mL/min，檢測器波長設置為250 nm。單糖標準品有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和巖藻糖。

樣品的水解、衍生及測定：精確稱取樣品至5.0 mL安瓿瓶中，加入2 mol/L 三氟乙酸 2.0 mL，封管，110 ℃ 酸解8 h。取出揮干三氟乙酸，加2.0 mL水復溶。按照標準品單糖的衍生方法衍生，上樣前過0.22 μm濾膜，測定。

1.2.4 大果白刺多糖的物理特性的測定

1.2.4.1 熱穩定性 采用熱重分析/差示掃描量熱法（TGA/DSC）分析大果白刺多糖的熱穩定性[20]。將2.0 mg的樣品放入坩堝中，在氮氣氣氛下，以10 ℃/min的升溫速度從25 °C加熱到700 °C。根據質量損失變化來衡量熱穩定性。

1.2.4.2 流變特性 室溫條件下，CNRFP用去離子水溶解，制成濃度為 0.1%、0.5%、1.0%和 2.0%CNRFP 溶液。測定溫度（25±0.1）°C，用錐形板（直徑40 mm，間隙0.5 mm），吸取1.0 mL多糖溶液于板件，記錄剪切速率在1~50 s?1范圍內多糖溶液黏度隨剪切速率的變化數值[21]。

1.2.4.3 醇溶性 參照王藝涵等[22]的方法并做修改。準備10 mL的不同濃度的乙醇溶液（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%），準確稱取 50.0 mg干燥至恒重的多糖樣品，分別加入其中，充分溶解后3000 r/min離心20 min，取上清液烘干至恒重。根據式（1）計算多糖的在乙醇溶液中的溶解度（S）：

式中：m為溶解至乙醇溶液的多糖質量，g；M為多糖樣品質量，g。

1.2.4.4 吸濕和保濕性 根據Chen等[23]的方法進行了一些修改。對CNRFP的吸濕性和保濕性進行了評估。將干燥的CNRFP（10 mg）置于培養皿中，并放置在恒溫濕度室中（20 ℃，相對濕度為85%）。定期對樣品稱重（2、4、6、8、10、12、12、24、36、48、60 h），并根據式（2）計算吸濕率：

式中：M0為吸水前樣品的質量，g；Mt為吸水后樣品的質量，g 。

通過比較濕CNRFP樣品的重量和在規定時間間隔（2、4、6、8、10、12、24、36、48、60 h）的干燥室中加熱至40 ℃后的重量來測定保濕率。保濕率的計算公式如下：

式中：H0為吸濕后樣品的含水量，g；Ht為加熱后樣品的含水量，g 。

1.2.4.5 發泡性和泡沫穩定性 按照先前報道描述的方法評估大果白刺多糖的發泡質性能[23]。在室溫條件下，均質機將 10 mL CNRFP溶液（1%、2%、3%、4%、5%；w/v）均化 60 s。摻入空氣并引起泡沫。攪打過的樣品立即進行管體積測量。分別記錄在t=0（初始泡沫體積）和30 min（最終泡沫體積）下的泡沫體積來測量發泡能力（FC）和泡沫穩定性（FS）。根據以下公式計算FC和FS：

式中：V0、V1、V2為多糖溶液初始體積、泡沫初始體積和30 min后泡沫體積，mL。

1.2.4.6 乳化性和乳化穩定性 用Liu等[24]報道的方法測量了CNRFP的乳化性質。大果白刺多糖溶液（10 mL，1%、2%、3%、4%和5%；w/v）中加入3 mL商業大豆油，溶液中加入0.04 g疊氮化鈉防止微生物生長。在室溫下10000 r/min攪拌2 min，然后1000 r/min離心10 min。用下式計算乳液容量（EC）：

式中：V1和V0分別是初始乳化層和初始溶液的體積，mL。

為了測試乳液穩定性（ES），將各乳液80 ℃加熱30 min，冷卻至約25 ℃，然后在1000 r/min下離心10 min。根據以下公式計算ES：

式中：V2和V0分別是乳化層和初始乳液的體積，mL。

1.2.5 抗氧化活性研究

1.2.5.1 DPPH自由基清除實驗 DPPH自由基清除實驗按照楊曉曦等[25]研究中描述的方法來測定并做一定修改。分別取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mg/mL的多糖溶液250 μL，依次加入0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液 500 μL。避光，室溫反應 30 min，在517 nm處測混合液的吸光值，空白組以去離子水代替多糖溶液，本底組以去離子水代替DPPH溶液，用Vc作陽性對照。按照公式（8）計算大果白刺多糖溶液對DPPH自由基的清除率：

式中：Aa：測定管吸光度值，Ab：測定管本底吸光度值，Ao：空白管吸光度值。

1.2.5.2 ABTS自由基清除實驗 ABTS自由基清除實驗參照史茹茹[26]方法并稍加修改。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mg/mL的多糖溶液250 μL，依次加入2.0 mLABTS工作液，常溫下避光反應6 min，蒸餾水作為參比，在734 nm處測多糖溶液的吸光值，用Vc作陽性對照。按照公式（9）計算大果白刺多糖溶液對ABTS自由基的清除率：

式中：A0：不加樣品，僅加入ABTS的吸光度，Ai：加入樣品和ABTS的吸光度。

1.2.5.3 羥基自由基清除試驗 參考文獻[26]并稍作修改。9 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL混勻，分別加入1 mL不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mg/mL）的多糖溶液和5 mL超純水，最后加入8.8 mmol/L雙氧水0.5 mL，混勻于37 ℃ 水浴30 min。在510 nm處測定吸光度值。用Vc作陽性對照。根據公式（10）計算清除率。

式中：A0為用超純水代替樣品的吸光度，A2為加入樣品的吸光度，A1為超純水代替雙氧水的吸光度。

1.2.5.4 總還原能力 按照試劑盒的操作說明進行測試。

1.3 數據處理

每個實驗重復三次，結果以平均值±標準差表示，實驗數據用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 粗多糖的組成

根據1.2.2的測定方法，繪制標準曲線，根據回歸方程，計算多糖中化學成分的含量，結果如表1所示。粗多糖的總糖含量為72.58%，這與先前對其他物種如小果白刺多糖的研究相似[27]。糖醛酸含量為20.14%，表明白刺果粗多糖為酸性多糖。此外，還含有8.44%的蛋白質，可能是多糖與蛋白質結合形成了糖蛋白綴合物。

2.2 單糖組成

大果白刺多糖的單糖組成結果見表1和圖1。白刺果粗多糖的單糖殘基含量由大到小分別是葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、木糖和巖藻糖。其中葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖含量較高，質量比為5.43:2.98:1.94。先前的研究表明小果白刺多糖的單糖組成為葡萄糖:半乳糖醛酸:半乳糖:阿拉伯糖:鼠李糖=41.4:30.5:122.6:11.8:3.70[27]。張玲等[28]研究發現河北滄州地區的白刺果水溶性多糖的單糖組成質量比為甘露糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=9.2:3.3:1.1:1:1.9:2.3。說明不同種類及地區的白刺果實中多糖的單糖組及含量具有較大差異。

表1 大果白刺粗多糖中化學成分含量和單糖組成Table 1 Content of chemical components and monosaccharide composition in CNRFP

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography

2.3 物理特性

2.3.1 熱穩定性分析 多糖在食品工業中的應用取決于熱特性。一般來說，多糖的熱穩定性基于其結構和官能團的變化[23]。大果白刺多糖的熱特性曲線根據質量損失可大致分為三個階段。如圖2所示，第一階段（25~125 °C）主要歸因于自由水和結合水的損失,說明大果白刺多糖經過冷凍干燥后仍然含有3.97%的水分。DSC曲線在125 °C附近有一個吸熱峰。第二個階段在125~586 °C范圍內測量到明顯的質量損失78.52%，這歸因于多糖結構的解聚。在此溫度范圍內，DSC曲線中大果白刺多糖的三個吸熱過程分別在307、446、565 ℃發生，最大峰出現在446 ℃，這是由于劇烈的分解反應，導致了碳鏈和氫鍵的斷裂。第三階段是熱穩定性階段，當溫度繼續升高時，觀察到多糖質量無明顯變化。700 ℃時CNRFP的殘留質量約為原始質量的17.25%。CNRFP的總質量損失為82.75%，高于白色羽扇豆多糖（78.21%）[23]和鷹嘴豆多糖（73.30%）[23]。以上結果表明，大果白刺多糖在25~125 °C溫度范圍內具有良好的熱穩定性。

圖2 大果白刺多糖的TG-DSC圖Fig.2 Thermal gravimetric and differential scanning calorimetric analysis of CNRFP

2.3.2 流變特性 黏度是多糖最顯著的乳化特征之一。圖3考察了剪切速率和濃度對CNRFP溶液黏度的影響。在剪切速率0.1~10 s?1范圍內，隨著剪切速率逐漸增大，多糖的黏度迅速下降，溶液呈剪切減薄狀態，當剪切速率大于20 s?1時，溶液的黏度逐漸趨于穩定。在相同的剪切速率時隨著濃度增大，黏度逐漸降低。所有的樣品都顯示出典型的“假塑性流體”行為，這是由于剪切力使溶液內部卷曲連接的分子結構被拉直，纏結點減少，從而表現為黏度下降[29]。先前的研究表明，低黏度在均勻化過程中有利于產生較小的油滴，而高黏度有利于乳液的穩定性[21]。剪切速率逐漸增大，溶液的黏度先急劇減小后無明顯變化。造成這一現象的原因，可能是在稀溶液中高分子因布朗運動而處于無規則分布狀態，當有外力存在時，高分子在流動場中，多糖分子由無序狀態開始向流動場的速度方向運動，使得溶液黏度降低[30]。

圖3 不同濃度的大果白刺多糖的黏度分析Fig.3 Viscosity analysis of CNRFP in different concentrations

2.3.3 醇溶性 大果白刺多糖的醇溶性如圖4所示，當乙醇濃度大于60%時，多糖很難溶于乙醇中，在較低的乙醇濃度中大果白刺多糖具有較高的溶解度。多糖的醇溶性與極性有關，高糖醛酸含量的多糖具有更多的親水基團，其分子極性大，在水中的溶解度更大，表現為更容易溶于低濃度的乙醇溶液中。

圖4 大果白刺多糖在不同乙醇濃度下的溶解度Fig.4 Solubility of CNRFP in different ethanol concentration

2.3.4 吸濕性和保濕性 如圖5所示，大果白刺多糖有一定的吸濕性。在0~12 h內隨時間的增加吸濕率逐漸增加，12 h后無明顯變化。多糖的吸濕性可能與結構特征、極性和孔隙率等有關[31]。大分子質量多糖與水分子結合后會形成網狀結構，保持水分。大果白刺多糖在0~8 h內水分損失較小，10~60 h水分急劇損失，60 h后的保濕率大于20%。雖然大果白刺多糖的吸濕率和保濕率（4.39%和24.24%）低于甘油（57.96%和41.97%）[32]，CNRFP也表現出了較強的吸濕能力。具有高保濕性的材料可以用作保濕劑、凝膠劑及化妝品的補充劑。

圖5 大果白刺多糖的吸濕性和保濕性Fig.5 Hygroscopicity and moisturizing of CNRFP

2.3.5 發泡性和泡沫穩定性 不同濃度的大果白刺多糖的發泡能力(FC)和發泡穩定性(FS)的結果如圖6所示，發泡能力均隨著大果白刺多糖濃度的增大而提高。CNRFP在低濃度（1%~2%）下產生少量的泡沫，但產生的泡沫不穩定，并在半小時內大量消散。當大果白刺多糖濃度為4%和5%，其發泡率分別為30.58%和42.16%。此外，泡沫穩定性也是隨著濃度的增大逐漸增大的。30 min后，在4%和5%濃度下觀察到泡沫體積減少最小，泡沫穩定性分別為26.32%和37.53%，而薄荷多糖在濃度4%和6%的發泡率和泡沫穩定性為29.28%、27.05%和44.92%、41.63%，CNRFP的發泡性能優于薄荷多糖[23]。發泡性和穩定性的增強可能歸因于大果白刺多糖在高濃度下形成網絡的能力的更強，從而穩定了界面膜，使得泡沫表面張力增大，泡沫穩定性增強[24]。大果白刺多糖可以用作食品配方中的發泡劑。

圖6 不同濃度的大果白刺多糖的發泡性能Fig.6 Foaming capacity of CNRFP at different concentrations

2.3.6 乳化性和乳化穩定性 如圖7所示，多糖的乳化能力和乳化穩定性均隨著CNRFP濃度的增加而增加。多糖的濃度為5%時，乳化能力和乳化穩定性分別為65.29%和38.21%，薄荷多糖濃度為6%時乳化能力為62.15%，乳化穩定性為38.82%，CNRFP的乳化率高于薄荷多糖但乳化穩定性略低，可能是由于CNRFP的蛋白質含量（8.44%）高于薄荷多糖中蛋白質含量（7.97%）[23]。結果表明大果白刺多糖可以用做食品的乳化劑。先前的研究表明，阿拉伯膠的共價偶聯蛋白是其優良乳化性能的關鍵[14]。多糖-蛋白復合物作為乳化劑可以改善乳液的穩定性。由于蛋白質的疏水基在油水界面可以被吸附到油滴上，親水性的多糖能增強油滴間的空間穩定力，從而增加了其穩定性[24]。 因此，多糖結構中的蛋白質是影響乳液的穩定性的關鍵因素，通過調節多糖與蛋白質結構來提高雙親性，從而提高乳化能力和穩定性。

圖7 不同濃度大果白刺多糖的乳化性能Fig.7 Emulsifying capacity of CNRFP at different concentrations

2.4 抗氧化活性

利用四種體外抗氧化活性測試方法，并與抗壞血酸進行對比，評估大果白刺多糖的抗氧化能力。如圖8A所示，不同濃度下的CNRFP對DPPH自由基清除能力隨著濃度增大而增大。當濃度為2.0 mg/mL時，有最大抑制率70.68%。在此濃度下，陽性對照Vc的清除率為94.76%，多糖和Vc的半數抑制濃度（IC50）值分別為1.14 mg/mL和0.44 mg/mL。CNRFP和Vc對ABTS自由基的清除活性如圖8B所示，在0~2.0 mg/mL濃度范圍內清除率從0~83.29%。CNRFP和Vc的半數抑制濃度（IC50）值分別為0.54 mg/mL和0.46 mg/mL。如圖8C所示，羥基自由基清除能力呈現出對濃度的依賴性，在濃度為2.0 mg/mL多糖的清除率為71.96%，CNRFP和 Vc的 IC50值為1.11 mg/mL和0.42 mg/mL。如圖8D所示，大果白刺多糖的還原能力與濃度呈正相關。還原能力通常與某些過氧化物前體反應并防止過氧化物形成的能力有關[33]。研究發現，糖醛酸含量可能會影響生物活性。大果白刺果多糖的羥基自由基半數清除率濃度高于來自突尼斯的小果白刺多糖（IC50=2.03 mg/mL），小果白刺多糖的DPPH自由基半數清除率濃度（IC50=0.87 mg/mL）高于CNRFP，可能是由于小果白刺多糖中糖醛酸含量（23.14%±0.24%）高于CNRFP中糖醛酸含量（20.14%±0.24%）[27]。結果表明，多糖具有良好的抗氧化活性，可用作自由基清除劑使用。

圖8 大果白刺多糖的抗氧化活性Fig.8 Antioxidant activity of CNRFP

3 結論

本研究旨在探討大果白刺粗多糖的功能特性和抗氧化活性，以期探索多糖在食品工業中的潛在應用。結果表明，通過水溶醇沉得到的水溶性大果白刺多糖，是含有少量糖醛酸和蛋白質的在25~125 ℃溫度范圍內表現出良好熱穩定性的多糖分子。采用高效液相色譜測定CNRFP中的單糖組成，含量較高的是葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸。此外，CNRFP對DPPH、ABTS和羥基自由基清除能力及總還原能力呈濃度依賴型。其中，CNRFP的清除DPPH、ABTS和羥基自由基半數清除率濃度（IC50）值分別為是1.14、0.54和1.11 mg/mL，結果表明大果白刺多糖具有較好的抗氧化活性。該研究為功能性食品和食品添加劑產業提供理論基礎。