大豆腦磷脂對漢麻分離蛋白Pickering乳液的形成及其性質的影響

朱秀清，王 源，朱 穎，孟 妍，李志敏，劉燕清

（哈爾濱商業大學食品工程學院, 黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室, 黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點實驗室, 黑龍江哈爾濱 150028）

漢麻，又稱大麻、線麻、火麻，在我國擁有悠久的種植歷史[1]，在紡織、榨油、制藥中[2?4]被廣泛應用。研究發現漢麻籽是一種重要的營養物質來源[5]，其中蛋白質含量在20%~25%[6]。對漢麻蛋白的研究始于20世紀初，主要集中于其在食品工業中的應用，如漢麻乳、漢麻蛋白粉及烘焙食品等[7?9]。在后續的研究中發現，漢麻籽蛋白具有α-葡萄糖苷酶抑制活性[10]及降血壓、調節血糖、抗氧化等生物活性，可以應用在功能性食品的研究與生產中[11]。

以固體顆粒代替表面活性劑作為乳化劑穩定的乳液稱為Pickering乳液，具有粒徑分布可控、低毒性、制備方法簡單等多種優點[12]。Pickering乳液的開發關鍵在于選擇具有合適表面潤濕性的乳化劑，近些年的研究集中在將不同來源的蛋白質作為乳化劑制備Pickering乳液[13]。Burgos等[14]以羽扇豆分離蛋白作為食品級Pickering乳液穩定劑，適當的加熱可以提高顆粒的界面性，儲存14 d后依然保持穩定；Feng等[15]用酪蛋白酸鈉修飾玉米醇溶蛋白顆粒制備Pickering乳液，與未修飾的蛋白相比，其具有更好的表面覆蓋率與離心穩定性；Jiao等[16]針對花生分離蛋白凝膠顆粒為穩定劑制備Pickering乳液進行研究，結果表明在不同pH條件下顆粒的聚集狀態不同，當乳液的連續相改變后，可獲得具有不同穩定機制的乳液；Liu等[17]發現大豆分離蛋白濃度越大，Pickering乳液的乳化穩定性越好，在一定的蛋白濃度下，油相占比越大，乳液的穩定性越好；Sui等[18]以大豆分離蛋白與卵磷脂為原料制備Pickering乳液，結果表明不同頻率超聲處理后乳液的乳化性會有不同程度的提高，較高頻率的超聲處理可降低乳液的穩定性。

蛋白質因具有良好的兩親性、乳化性、凝膠性，且植物蛋白具有來源廣、成本低等優點，在食品工業和制藥工業中常被用作穩定O/W型乳液的乳化劑[19]。與其它植物蛋白相比，漢麻蛋白的乳化性稍差[20]，可通過適當的修飾以提高其功能特性。Dap?evi?-Hadna?ev等[21]通過不同的分離技術制備漢麻分離蛋白 (hemp protein isolate, HPI)，并對其乳化性進行評價，發現在HPI穩定的乳液中，分離技術有利于pH誘導的蛋白質分子結構的展開、疏水位點和巰基的暴露，以及在乳化過程中由蛋白質連接的液滴聚集體的形成；王慶玲[22]研究了不同改性方法對漢麻蛋白功能特性的影響，并發現高壓均質可使油滴更好地被漢麻蛋白包裹，形成液滴顆粒粒徑小且分布均勻的乳液、熱輔助pH偏移使蛋白質在油-水界面的表面活性顯著增強，有利于蛋白質乳化活性的提高；Chuang等[23]以麻仁球蛋白-酪蛋白酸鈉納米顆粒為原料制備Pickering乳液，發現納米顆粒中麻仁球蛋白占比越大，類固體性質增加的程度越明顯，乳液的流動性越差。

磷脂作為一種重要的兩性表面活性劑，具有良好的乳化作用及界面吸附作用，在食品加工過程中以乳化劑的形式存在，也可以與其它穩定劑結合起到乳化作用。研究表明[24]磷脂與食品中植物蛋白質結合后可以改善食品的可食用品質、增強其營養價值，在食品工業中具有很好的應用價值。磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)，簡稱腦磷脂，其在蛋黃磷脂中含量僅次于卵磷脂，與卵磷脂相比，腦磷脂含有更多的多不飽和脂肪酸，具有改善智力、促進大腦發育的功效，可以用來修飾蛋白質以提高蛋白質的功能特性及食用品質。目前對大豆腦磷脂(soybean phosphatidyl ethanolamine, SPE)協同穩定漢麻分離蛋白Pickering乳液還鮮有報道，本文通過改變SPE的添加量，探究SPE協同穩定HPI乳液對乳液的乳化性、微觀形貌、粒徑、Zeta電位、流變特性、貯藏穩定性的影響，研究HPI作為一種新型的乳化劑在Pickering乳液中的應用，為HPI穩定Pickering乳液的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漢麻籽 廣西巴馬；大豆腦磷脂 美國Sigma公司；大豆油 九三糧油工業集團有限公司；所有分析用試劑 均為國產分析純。

BS224S型分析天平 賽多利斯科學有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限公司；PCE-E3000型恒溫振蕩器 蘇州凱特爾儀器設備有限公司；Marvin 3000型馬爾文激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；TG16-WS型離心機 湘儀實驗室儀器開發有限公司；XHF-DY型高速分散機 上海圣科儀器設備有限公司；pH-20型pH計 杭州杰源儀器科技有限公司；722E型分光光度計 上海圣科儀器設備有限公司；Anton-Paar MCR 302 動態流變儀 奧地利安東帕有限公司；XSP-BM-30AD顯微鏡 上海彼愛姆光學儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 漢麻分離蛋白的制備 漢麻分離蛋白（HPI）的制備參考Yin等[25]的方法并稍作修改。將漢麻籽與正己烷按1:8（g/mL）的比例混合進行脫脂，在室溫下振蕩8 h后，烘干、粉碎備用。將脫脂的漢麻籽與去離子水以1:20（g/mL）的比例進行混合制備漢麻分離蛋白，用1 mol/L的NaOH溶液調節料液pH為8.5，在室溫下振蕩浸提 1 h 后，以 4000 r/min 的轉速離心 20 min，過濾后保留上清液，用 1 mol/L 的HCl溶液調節上清液pH為4.7后，在室溫下靜置0.5 h，以 4000 r/min 的轉速離心 20 min，過濾后收集沉淀，溶于水后調節pH至7.0，將其冷凍干燥后得到 HPI（蛋白質含量92.47%），于?4 ℃ 下保存。

1.2.2 Pickering 乳液的制備 根據 Sui等[18]的方法稍作修改進行乳液的制備，將漢麻分離蛋白溶于0.01 mol/L磷酸鹽溶液（pH為 7.0），配制質量濃度為2%的漢麻分離蛋白溶液，加熱至45 ℃，磁力攪拌2 h后，以漢麻分離蛋白溶液與大豆腦磷脂的比例為4:1制備乳液,并置于高速分散器下，以12000 r/min的轉速處理2 min后制得Pickering乳液。

為研究SPE的添加量對乳液微觀結構與性能的影響，以未添加SPE的乳液作為空白對照組，在蛋白溶液中加入HPI添加量10%、20%、30%、40%的SPE，按上述步驟進行乳液的制備，并對添加SPE的乳液和空白對照組的各項指標進行測定與分析。

1.2.3 乳液乳化活性的測定 乳液乳化活性測定參考Pearce等[26]與李良等[27]的方法并稍作修改。利用1.2.2的方法制備乳液，制得HPI-SPE乳液后取乳化層50 μL，用質量分數為0.1%的SDS溶液稀釋至5 mL。充分混勻后，取其底部乳液進行測定，以0.1%的 SDS 溶液為空白對照，利用紫外可見分光光度計測其在500 nm波長處的吸光值，平行測定三次，取其平均值。乳液的乳化活性用乳化活性指數（EAI）表示，其計算公式如下所示：

式中：T=2.303；A0為乳液在波長為 500 nm 處的吸光值；C為蛋白質單位體積質量（g/mL）；φ為油相占比；N為稀釋倍數（n=100）。

1.2.4 乳液微觀觀察 將適量乳液滴在干凈載玻片上，確保沒有氣泡產生后，用蓋玻片蓋緊，放置于透反偏光顯微鏡下對其形態特征進行觀察并拍照。

1.2.5 乳液粒徑及 Zeta電位測定 乳液粒徑及Zeta電位測定參照Xu等[28]的方法并稍作修改。采用馬爾文激光粒度儀對HPI-SPE乳液的粒徑及Zeta電位進行測定。以磷酸緩沖液（pH7.0）為溶劑，顆粒折射率為1.470，吸收率為0.001，分散劑折射率為 1.330，以體積平均直徑（D4,3）表征粒徑。 HPISPE 乳液用 50 mmol/L 的磷酸緩沖液（pH 為 7.0）稀釋至澄清透明后進行測定，上樣體積為1 mL，測定溫度為室溫。重復測量3次，取其平均值作為測定值。

1.2.6 乳液表觀黏度的測定 使用流變儀測量HPISPE乳液的流變行為，測定其表觀黏度。設置PP-50模具平板間的間隙為1 mm，剪切速率設置為0.1~300 s?1，在 25 ℃ 下平衡 5 min，對 Pickering 乳液的表觀黏度進行測定[29]。

1.2.7 乳液的貯藏穩定性測定 取不同SPE添加量的Pickering乳液適量裝入離心管中，觀察剛均質后的乳液的乳析層并進行拍照。后將所有乳液置于4 ℃ 冰箱冷藏 7 d，7 d 后通過取出觀察乳液乳析層的變化并進行拍照，以此對乳液的穩定性進行評價。

1.3 數據處理

所有數據重復測定三次，實驗數據以“平均值±標準誤差”的形式表示，數據采用SPSS 19.0進行ANONA 單因素方差分析，并采用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液乳化活性的影響

由圖1知，乳液的乳化活性指數隨SPE添加量的增加出現先升高后降低的趨勢，并在添加量為30%時達到最大值為4.63 m2/g，隨著SPE添加量的繼續升高，乳化活性指數出現降低的情況。表明添加SPE后乳液的乳化性較未添加SPE時有明顯的提升，這是由于界面蛋白質含量的提高以及高黏彈性膜的形成[30]，使乳化體系表現出良好的乳化性能；當SPE添加量為40%時，乳化活性有所降低。李秋慧等[31]的研究發現，在大豆分離蛋白-磷脂乳化體系中，加入一定量的大豆卵磷脂可適當提高乳液的乳化活性，當大豆卵磷脂添加量達到15%后，乳化活性有所下降。這是由于添加SPE后，磷脂的疏水基團與蛋白質的疏水基團可以很好地覆蓋在油滴表面將其包裹，磷脂的親水基團與蛋白質的親水基團可以更好地延伸入水中，形成雙親結構，使乳液的穩定性提高；當SPE添加量達到一定程度后，HPI與SPE的結合達到飽和，SPE會形成部分與乳液大小不同的液滴，使乳液液滴分布不均勻、粒徑不同，出現聚集、遷移等現象，從而導致乳化活性降低。

圖 1 SPE 添加量對 HPI乳液乳化活性的影響Fig.1 Effect of different SPE content on emulsion activity of HPI emulsion

2.2 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液微觀結構的影響

從圖2中可以看出，未添加SPE的蛋白溶液雖未出現液滴聚集現象，但液滴顆粒分布不均勻。在添加SPE后，HPI可以更好地覆蓋油滴表面，分布均勻，形成更穩定的乳液體系。隨著SPE添加量的增加，顆粒尺寸先增大后減小，當SPE添加量為30%時，顆粒分布的均勻程度最好；在SPE添加量為40%時，顆粒分布的均勻程度有所降低，出現更大尺寸的顆粒，這可能是由于SPE添加過量時會形成部分與乳液大小不同的液滴，使乳液液滴分布不均勻、粒徑不同。因此，適量添加SPE有助于乳滴更加均勻分布，提高乳液的乳化性，形成更加穩定的乳液體系。

2.3 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液粒徑的影響

乳液的粒徑大小可以用來評價乳液的穩定性，乳液液滴的粒徑越小，其乳析速度越慢，乳液就越穩定[32]，因此可以通過觀察乳液液滴粒徑大小來判斷制得的HPI-SPE乳液的穩定性。如圖3所示，隨著SPE添加量的提高，乳滴粒徑呈現先升高后降低的趨勢，并在SPE添加量為30%時達到最小值為125 nm，此時形成的乳液分布更為均勻，穩定性更好；當SPE添加量為40%時，乳滴粒徑增加，形成的乳液穩定性降低。這說明，適當添加SPE可以使更多的SPE與HPI結合，形成粒徑更小的乳滴，增加乳液的穩定性。

圖 2 SPE 添加量對 HPI乳液微觀結構的影響Fig.2 Effect of different SPE content on microstructure of HPI emulsion

圖 3 SPE 添加量對 HPI乳液粒徑的影響Fig.3 Effect of different SPE content on particle size of HPI emulsion

乳液的分散指數（PDI）可以用來判斷乳液的粒徑分布，PDI值越小，其顆粒分布越均勻，所形成的乳液體系越穩定。當SPE添加量為30%時，PDI值達到最小為0.23，此時乳液分散程度最好，與上文乳液微觀觀察的實驗結果一致；當SPE添加量為40%時，乳滴粒徑的增加導致其不能很好地分散于乳液體系中，從而導致PDI值增加。韓天翔等[33]對磷脂-大豆乳清蛋白乳化體系的研究指出乳滴的粒徑越小, 乳液越不容易發生絮凝、聚集等現象, 乳液的穩定性越好。因此，添加SPE有助于乳液液滴的均勻分布，減少油滴聚集，形成更穩定的乳液體系。

2.4 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液Zeta電位的影響

Zeta電位通常可以通過表征顆粒間相互吸引的能力來判斷溶液體系的穩定性[34]，其穩定性由Zeta電位的絕對值表示，絕對值越高，粒子間的排斥力越大，越不容易發生聚集，溶液體系越穩定。由圖4所示，隨SPE添加量的增加，Zeta電位的絕對值呈現先增加后減小的趨勢，當SPE添加量30%時Zeta電位值為?27.12 mV，形成的乳液電位絕對值最大。HPI表面帶負電，SPE顆粒帶負電，SPE與HPI相互作用使蛋白質結構改變，內部的負電荷釋放出來，乳液的負電位絕對值增加，隨乳液中SPE添加量的增加，蛋白質顆粒間靜電斥力增大，越不易發生聚集，乳液的穩定性也逐漸增強；當SPE添加量30%時，乳液表面攜帶的負電荷量最多，Zeta電位值最大，受粒子間的排斥作用影響，此時乳液最穩定。當SPE添加量為40%時，Zeta電位的絕對值減小，但仍高于未添加SPE的乳液，這可能是由于SPE加入量到達飽和后無法通過增加與蛋白質間的靜電斥力來穩定乳液，從而導致Zeta電位減小。研究表明磷脂-大豆乳清蛋白乳液乳滴的粒徑越小, Zeta電位值越大, 乳滴間的靜電排斥作用越強，乳液的穩定性越好[33]，與本實驗趨勢一致。

圖 4 SPE 添加量對 HPI乳液 Zeta 電位的影響Fig.4 Effect of different SPE content on Zeta potential of HPI emulsion

2.5 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液表觀黏度的影響

流變學旨在研究物質在外力作用下產生的變形和流動，根據流變曲線形狀，流體被分為牛頓流體和非牛頓流體兩類，非牛頓流體的黏度取決于溫度、剪切速率和剪切應力，因此又可將非牛頓流體分為膨脹型流體、塑性流體及假塑性流體三類[27,35]。如圖5所示，隨著剪切速率的增大，乳液黏度逐漸減小，表現出典型的非牛頓假塑性行為，即剪切稀化，是典型的弱締合相互作用。當剪切速率≤200 s?1時，SPE添加量為10%乳液的表觀粘度最低，這是由于凝集狀態的油滴在剪切過程中相互分離而產生的結果；當剪切速率≥200 s?1時，SPE 添加量為 30% 時，表面蛋白吸附量最大，液滴因攜帶負電相互排斥，表觀黏度最低，流動性最好。當SPE添加量為40%時，表觀黏度最大，有研究表明隨著表觀黏度的增加，油滴間接觸面積隨之增加，彼此間相互作用，形成了聚集的網絡結構[36]，這種情況可能是由于液滴顆粒相互碰撞、凝聚，使得乳液具有相當高的內部阻力阻礙流動，所以表現出較高的黏度。

圖 5 SPE 添加量對 HPI乳液表觀黏度的影響Fig.5 Effect of different SPE content on apparent viscosity of HPI emulsion

2.6 SPE添加量對漢麻分離蛋白Pickering乳液貯藏穩定性的影響

如圖6所示，不同SPE添加量下漢麻分離蛋Pickering 乳液的外觀不同。圖6（a）為新鮮乳液的外觀，圖6（b）為在4 ℃條件下冷藏7 d后乳液的外觀，若乳液的乳析層出現破乳等現象，則說明乳液的穩定性不好[37]。從圖6（a）可以觀察到新鮮制得的乳液是均勻的，未出現乳析或分層現象，說明未添加及添加SPE的乳液穩定性良好；從圖6（b）中可以觀察到4 ℃冷藏 7 d后，未添加SPE的乳液水油分離，添加SPE的乳液未出現明顯的分層現象，這與葛慧娟等[38]研究得出的蛋白質-多糖復合物穩定的乳液未出現分層和析油現象，表明乳液具有良好的貯藏穩定性的結論一致。

圖 6 SPE 添加量對 HPI乳液的貯藏穩定性的影響Fig.6 Effect of different SPE content on storage stability of HPI emulsion

2.7 漢麻分離蛋白-大豆腦磷脂Pickering乳液穩定機制解析

由SPE包裹的HPI（SPE-HPI）穩定乳液的機理圖如圖7所示，在乳液體系中加入SPE后，SPE與HPI結合可以更加均勻地包裹油脂顆粒，使其粒徑更小，不容易聚集，乳液具有很好的穩定性，且通過調節HPI與SPE 的比例可以獲得穩定性不同的乳液。磷脂包裹的液滴主要是通過電荷的排斥作用來抑制液滴聚集，從而起到穩定乳液的目的[39]。當pH大于4.65時，HPI表面帶負電荷[40]，在中性或堿性條件下，被磷脂包裹的液體通常具有較高的負電荷，二者通過產生強烈的靜電作用而避免顆粒的聚集，乳液的穩定性增加。上述實驗結果表明，在HPI乳液中添加適量的SPE后，乳液的乳化活性增加，且流動性更好，Zeta電位絕對值增加，乳滴間的靜電斥力增加，可以避免乳滴聚集，使乳滴均勻分布于乳液中，乳滴粒徑減小、分布更均勻，可提高乳液穩定性。當HPI乳液中加入SPE后，由于二者間靜電排斥作用，HPI結構展開，內部的疏水基團暴露，腦磷脂尾部的疏水基團與蛋白質的疏水基團覆蓋在油滴表面，腦磷脂頭部的親水基團與蛋白質的親水基團延伸入水中，形成雙親結構，提高乳液穩定性。因此可以說明，以SPE包裹的HPI顆粒代替傳統的表面活性劑作為乳化劑可以很好地起到穩定Pickering乳液的作用。

圖 7 SPE-HPI穩定 Pickering 乳液機理圖Fig.7 Mechanism diagram of SPE-HPI stabilized Pickering emulsion

3 結論

采用HPI與SPE為穩定劑制備 Pickering 乳液，通過調節SPE的添加量，得到穩定性較好的O/W型Pickering 乳液。與未添加SPE的乳液相比，添加SPE的乳液乳化活性、乳滴粒徑、分散程度、Zeta電位、流變特性等指標均有所提升，在貯存7 d后仍保持穩定。當SPE添加量為30%時，乳液的乳化活性最好，液滴顆粒較小且分布均勻，形成的乳液體系最穩定。該實驗結果為大豆腦磷脂-漢麻分離蛋白穩定的Pickering乳液的開發與其在食品工業中的應用提供了理論基礎。